基因芯片技術(shù)在抗腫瘤藥物研究和腫瘤診斷中的應(yīng)用

曹明楠，崔 俊，李衛(wèi)東

(1.北京大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，北京 100191；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院新生兒外科，沈陽 110004；3.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191)

基因芯片技術(shù)在抗腫瘤藥物研究和腫瘤診斷中的應(yīng)用

曹明楠1，崔 俊2，李衛(wèi)東3

(1.北京大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，北京 100191；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院新生兒外科，沈陽 110004；3.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100191)

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用于機(jī)體,通過多步驟誘變過程導(dǎo)致多個(gè)癌基因激活和抑癌基因失活,細(xì)胞發(fā)生包括凋亡調(diào)節(jié)和DNA修復(fù)損傷等一系列生理功能改變的結(jié)果。基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一種新興分子生物學(xué)技術(shù),在基因分析方面具有高通量、多因素、微型化和快速靈敏等特點(diǎn),因此將基因芯片技術(shù)運(yùn)用到涉及眾多基因改變的腫瘤研究中,可以更全面地了解腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制,為腫瘤的診治打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文就近些年來基因芯片技術(shù)在抗腫瘤藥物的作用機(jī)制篩查、藥物篩選和毒理學(xué)研究、藥物基因組學(xué)、腫瘤診斷以及尋找腫瘤相關(guān)基因等抗腫瘤領(lǐng)域的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

寡核苷酸序列分析；抗腫瘤藥；治療應(yīng)用

隨著研究的不斷深入，人們對腫瘤發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識有了長足的進(jìn)步?，F(xiàn)在已經(jīng)可以確定腫瘤是通過多步驟誘變過程獲得類似的一系列生理功能而形成的，這些生理功能包括自給自足的生長信號、凋亡信號耐受以及無限增殖的能力等[1]。在發(fā)病機(jī)制理論的導(dǎo)向下，腫瘤的化學(xué)預(yù)防即用天然的或合成的化學(xué)物質(zhì)阻止、逆轉(zhuǎn)和減緩癌癥發(fā)展的抗腫瘤領(lǐng)域飛速發(fā)展[2]，并且已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)某尚?。例如，近年來，美國除個(gè)別一些癌癥如肺癌、結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢外，總體癌癥的發(fā)病率和死亡率都在持續(xù)降低[3]，但仍是首位死因。相較之下我國的情況就頗為嚴(yán)峻，根據(jù)2013年中國腫瘤登記年報(bào)，全國每年新發(fā)癌癥病例約為312萬，癌癥死亡病例約為270萬，按目前人均期望壽命計(jì)算，我國居民一生當(dāng)中罹患癌癥的概率為22%，即每5個(gè)人中就會有1人會患癌癥[4]，癌癥負(fù)擔(dān)仍逐年上升。因此，尋找有效的抗腫瘤藥物與治療方法，仍舊是全球醫(yī)學(xué)界努力的目標(biāo)，而大規(guī)?？焖俸Y選、組合化學(xué)、基因工程等先進(jìn)技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用則加速了抗腫瘤藥物的開發(fā)進(jìn)程[5]，抗腫瘤藥物正從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物，向多環(huán)節(jié)作用機(jī)制的新型藥物發(fā)展[6]。

現(xiàn)代腫瘤治療是以腫瘤中發(fā)現(xiàn)的異?；蜃鳛榛A(chǔ)而進(jìn)行的[7]。當(dāng)前腫瘤治療面臨的最主要挑戰(zhàn)是發(fā)現(xiàn)特定階段癌癥異常表達(dá)的基因(群)，并且明確這些差異基因的功能和干預(yù)這些基因表達(dá)的結(jié)果，最終將這些信息轉(zhuǎn)化成新的診斷和治療策略。解決這個(gè)問題有兩種基本方法:一是基于基因的個(gè)案分析尋找與疾病的特定關(guān)聯(lián)；二是基于基因組廣泛篩查的高通量結(jié)果分析基因表達(dá)情況，既可以定性分析突變信息也可以定量分析基因表達(dá)情況[8]。第一種方法主要用于確定差異基因和給定疾病的因果關(guān)系并最終驗(yàn)證差異基因作為抗癌靶標(biāo)的潛力，而第二種方法因其是采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析差異基因和給定疾病之間微弱的關(guān)聯(lián)從而普遍適用于差異基因的廣泛篩查。基因表達(dá)連續(xù)分析(serial analysis of gene expression，SAGE)和基因芯片是高通量基因表達(dá)分析的核心技術(shù)。1995年，美國斯坦福大學(xué)Schena等首次發(fā)表了關(guān)于應(yīng)用二維玻璃載體DNA微陣列探針的論文，開創(chuàng)了基因芯片應(yīng)用的先河[9]。通過基因芯片技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行許多基因的檢測，克服了傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法只能對某一個(gè)或某幾個(gè)基因進(jìn)行研究的局限性，可以從疾病和藥物兩個(gè)角度對生物體多個(gè)參量同時(shí)進(jìn)行研究，以發(fā)掘藥物潛在靶點(diǎn)并獲取大量相關(guān)信息[10]，因此，基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)使綜合、系統(tǒng)地分析某些基因功能以及分析不同基因之間的相互作用成為可能。另外，采用基因芯片對基因表達(dá)進(jìn)行分析，可隨時(shí)獲取腫瘤細(xì)胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)基因的表達(dá)模式，以便對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有一個(gè)系統(tǒng)、深入的闡析[11]。由此可見，在抗腫瘤研究領(lǐng)域，任何一元化或相對一元化的分析方法均不及基因芯片的分析手段更具有優(yōu)勢。

1 基因芯片技術(shù)概述

基因芯片的最基本原理是Southern提出的核酸雜交理論，即被標(biāo)記的核酸分子能與固定的、與之互補(bǔ)配對的核酸分子雜交[12]。基于此理論將探針分子按一定的二維結(jié)構(gòu)固定于固相載體上，與標(biāo)記樣品分子進(jìn)行雜交反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果用同位素法、化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法顯示，然后用精密的掃描儀或激光共軛聚焦攝像技術(shù)記錄，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析、綜合[13]即可獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息[14－15]。通過基因芯片技術(shù)能在一塊或若干塊載體上完成樣品的分離、制備、生化反應(yīng)的進(jìn)行如核酸產(chǎn)物的分離、雜交以及PCR等生物過程，在基因分析方面具有高通量、多因素、微型化和快速靈敏的特性[13]。

基因芯片技術(shù)主要包括4個(gè)基本環(huán)節(jié):芯片制備、樣品制備和標(biāo)記、雜交反應(yīng)以及信號檢測[16]。目前已有多種方法用于構(gòu)建基因芯片，最主要的有兩種:一種在同相載體表面進(jìn)行原位合成；另一種是點(diǎn)樣法，直接將大量合成好的探針通過機(jī)器人有序地點(diǎn)印在芯片表面。根據(jù)芯片所用的基因探針類型不同，可以分為原位合成寡核苷酸點(diǎn)陣芯片和用微量點(diǎn)樣技術(shù)制作的互補(bǔ)DNA(cDNA)點(diǎn)陣芯片兩大類；根據(jù)芯片的功能不同可將基因芯片分為表達(dá)譜芯片和DNA測序芯片；根據(jù)應(yīng)用范圍不同可將基因芯片分為各種專用型芯片，如病毒檢測芯片、表達(dá)譜芯片、指紋圖譜芯片、診斷芯片、測序芯片、基因多態(tài)性芯片、微縮芯片和毒理學(xué)芯片等[17－18]。

針對基因芯片的費(fèi)用所導(dǎo)致的進(jìn)行基因芯片分析的樣本量的局限性，Chen等[19]提出了一種基于模型的信息共享方法(MBIS)，通過利用基因之間共享信息提高統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的精確度，這就大大彌補(bǔ)了不能進(jìn)行t檢驗(yàn)，SAM和FDR等傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所帶來的精確度上的損失。

表觀遺傳修飾在基因調(diào)控中的作用已經(jīng)被廣泛研究。Zhao等[20]深入研究了基因表觀遺傳修飾與小干擾RNA(miRNA)介導(dǎo)的基因網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)合調(diào)解。他們進(jìn)行了全基因組研究表明DNA甲基化與miRNA在基因調(diào)控上相輔相成。這一發(fā)現(xiàn)將通過聯(lián)合表觀遺傳和miRNA兩因素而推動我們對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測模型的建設(shè)。

有很多研究者致力于傳統(tǒng)生物信息學(xué)領(lǐng)域中?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)(MGED)學(xué)會成立于1999年，其主要功能是通過數(shù)據(jù)集成和標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)生物和生物醫(yī)學(xué)的新發(fā)現(xiàn)。為了促進(jìn)通過高通量技術(shù)產(chǎn)生的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)的共享，學(xué)會于2010年正式更名為功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)(FGED)學(xué)會，并完成了數(shù)據(jù)質(zhì)量，管理，注釋和交換標(biāo)準(zhǔn)的建立[21]。

早在20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們就提出了很多關(guān)于DNA或蛋白質(zhì)序列的比對算法，但多重序列比對直至現(xiàn)在仍然是極具挑戰(zhàn)性的問題，它計(jì)算強(qiáng)度體現(xiàn)了下一代測序技術(shù)的進(jìn)步。Tang等[22]就提出一個(gè)可靠的方法來減少超聲圖像后處理中存在的障礙。他們使用一個(gè)細(xì)節(jié)保留的各向異性擴(kuò)散過濾器達(dá)到了即可以阻止過度擴(kuò)散并且可以保存重要的結(jié)構(gòu)信息的目的。

現(xiàn)在的基因芯片技術(shù)可以完成全基因組表達(dá)譜分析，例如Venkataraman等[23]于2013年發(fā)明了一個(gè)新的原位合成寡聚核苷酸芯片的方法，該芯片用于分析結(jié)核分枝桿菌，囊括迄今為止最為全面的結(jié)核分枝桿菌基因組信息，其中部分基因是尚未闡明其生物學(xué)功能的。

2 基因芯片技術(shù)在抗腫瘤藥物研究中的應(yīng)用

2.1 抗腫瘤藥物作用機(jī)制的篩查

藥物靶標(biāo)是指機(jī)體內(nèi)具有某些藥效功能并可被特定藥物作用的生物大分子，如某類蛋白質(zhì)或核酸等。尋找藥物靶標(biāo)即在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行基因序列測定和基因表達(dá)水平分析，繼而從蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子中找出少數(shù)適合的藥物作用靶點(diǎn)，是抗腫瘤藥物作用機(jī)制篩查的重要方面。因?yàn)檫x擇適合的藥物靶標(biāo)是基于機(jī)制篩選藥物以及定向合成的關(guān)鍵因素之一，在藥物開發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)和選擇適合的靶標(biāo)是藥物開發(fā)的第一步。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展往往是抑癌基因的突變或缺失、原癌基因的異常擴(kuò)增和表達(dá)以及多個(gè)基因協(xié)同作用，通過多步驟誘變過程獲得無限增殖的潛能、自給自足的生長信號以及凋亡信號耐受等類似的一套生理功能的結(jié)果。雖然目前越來越多的腫瘤相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，但由于傳統(tǒng)技術(shù)方法，如PCR、Northern印跡等一次僅能對1個(gè)或少數(shù)幾個(gè)選定基因進(jìn)行研究，所以仍存在很大的進(jìn)步空間。利用基因芯片則可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)獲取不同腫瘤細(xì)胞生長各期與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因表達(dá)模式，還可以比較正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)的變化情況和變化幅度，從而發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因，作為藥物篩選的候選靶標(biāo)[24]。

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤，在美國癌癥相關(guān)死因中占第二位[3]。其發(fā)生發(fā)展包括前列腺上皮內(nèi)瘤期、侵襲性癌癥期、雄激素依賴或不依賴的轉(zhuǎn)移期等[25]。在前列腺的早期癌階段，一般通過手術(shù)或放化療是可治愈的，基于前列腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)2篩查檢測工作也已經(jīng)有很多早診病例[26]。盡管血清PSA是目前公認(rèn)最好的前列腺腫瘤標(biāo)記物，但在男性阻塞性或炎癥尿路疾病中PSA水平可升至4～10 μg·L－1，因此，PSA作為前列腺癌的標(biāo)記物不具備足夠的特異性[27]。采用基因芯片技術(shù)分析人類癌癥中基因表達(dá)差異的系統(tǒng)研究表明，基因芯片是一個(gè)快速而有效的識別候選標(biāo)記物以及藥物靶標(biāo)的方法[28]。Welsh等[29]應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析了一系列正常組織和惡性前列腺組織中＞8900種基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示大約有400個(gè)基因在腫瘤組織中是過表達(dá)的。其中巨噬細(xì)胞分泌的抑制性細(xì)胞因子、MIC-1等已確定可以參與多種生化途徑并編碼具有診斷潛力的分子，另外一些基因如脂肪酸合成酶，則可以編碼已知的藥物靶標(biāo)。這些結(jié)果表明，利用基因芯片研究不同類型前列腺癌的基因表達(dá)譜，能迅速發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因，從而準(zhǔn)確地對其進(jìn)行病理學(xué)分類，同時(shí)為其他方法獲得的研究結(jié)果提供進(jìn)一步的參照。繼續(xù)深入研究，可能發(fā)現(xiàn)更具本質(zhì)性的診斷和分類標(biāo)志，并且可能為前列腺癌的抗腫瘤藥物確立新的作用靶標(biāo)。Scherf等[30]利用cDNA芯片分析了美國國立癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)在新藥篩選中用到的60種人類腫瘤細(xì)胞系的基因表達(dá)譜，并通過所獲取信息說明了生物信息學(xué)和藥物化學(xué)信息之間的聯(lián)系，提供了探索新靶標(biāo)的很多切入點(diǎn)。

2.2 用于抗腫瘤藥物的篩選

傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物篩選主要有兩種，一是從研究腫瘤病生理的生化途徑開始，找出對病變起關(guān)鍵作用的受體或酶，然后將受體或酶從動物組織中提取并純化，接著各種可能的藥物作用于靶分子，篩選出對該疾病可能具有治療作用的藥物；二是應(yīng)用細(xì)胞或動物模型進(jìn)行篩選。但這種直接通過生物系統(tǒng)進(jìn)行藥物篩選的方法具有耗費(fèi)大、時(shí)間長、低通量等諸多缺點(diǎn)。NCI自1985年起就調(diào)整篩選策略，采用半自動快速比色測定方法重點(diǎn)進(jìn)行人類特殊類型腫瘤的選擇性篩選，這的確是一種快速、高通量的篩選體系，但NCI也鼓勵(lì)基于分子機(jī)制的藥物篩選方案，以補(bǔ)充其細(xì)胞篩選。NCI領(lǐng)導(dǎo)的研究小組已經(jīng)開始研究基于基因芯片技術(shù)進(jìn)行的藥物篩選體系。基因芯片技術(shù)允許在對化合物具體作用機(jī)制不夠了解的情況下，直接分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)譜的變化，構(gòu)建基因表達(dá)圖譜，通過分析基因表達(dá)譜，分析病理學(xué)、生理學(xué)的原因，高效率地篩選出新的藥物或先導(dǎo)化合物。當(dāng)數(shù)據(jù)積累到足夠多時(shí)，就可將一種未知性質(zhì)的新化合物的圖譜與已知藥物作用后的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，并預(yù)測其藥物作用類型。在此初篩基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)直接證實(shí)藥物的作用方式及機(jī)制[30]。因此，基因芯片技術(shù)不僅具備半自動快速比色測定方法的快速、高通量優(yōu)點(diǎn)，還可以在分子水平上了解其作用特點(diǎn)及機(jī)制。

2.3 在抗腫瘤藥物毒理學(xué)研究的應(yīng)用

藥物的安全性評價(jià)和毒性檢測是新藥研發(fā)上市的重要前提，也是藥物質(zhì)量的安全性、有效性、質(zhì)量可控性的主要標(biāo)志。以往抗腫瘤藥物大多通過嚙齒類為主的動物實(shí)驗(yàn)來確定其潛在毒性。但這種方法不僅需要高劑量的藥物，且耗時(shí)長、花費(fèi)大[31]。美國國立環(huán)境衛(wèi)生研究院毒理委員會決定，通過發(fā)展更為有效的替代方法以減少動物的使用量?；蛐酒夹g(shù)將藥物毒性與基因表達(dá)特征聯(lián)系起來，通過對特征表達(dá)基因進(jìn)行深入分析便可全面分析藥物潛在毒性[32]，是現(xiàn)有體外實(shí)驗(yàn)如Ames實(shí)驗(yàn)和微核實(shí)驗(yàn)等的重要補(bǔ)充。

近年來，美國環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所(NIEHS)的研究小組研制了一種毒理芯片，該芯片涉及的基因包括凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、氧化應(yīng)激、DNA復(fù)制與修復(fù)等，其原理是通過檢測化合物作用于細(xì)胞后基因的改變來研究其毒性。Waring等[33]將15種可引起肝細(xì)胞損傷、硬變、增生及肝腫瘤發(fā)生的已知具有肝毒性的化學(xué)試劑作用于大鼠，然后應(yīng)用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)的聚類分析，發(fā)現(xiàn)基因芯片結(jié)果與組織病理結(jié)果及臨床生化結(jié)果之間具有明顯的相關(guān)性。這一結(jié)果表明，基因芯片技術(shù)是高度敏感的可用于候選藥物安全性篩選和環(huán)境毒物分類的技術(shù)。他莫昔芬是一個(gè)選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于治療雌激素受體陽性乳腺癌患者。然而在臨床試驗(yàn)期就發(fā)現(xiàn)他莫昔芬可能導(dǎo)致肝脂肪變性。Lee等[34]應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)他莫昔芬導(dǎo)致肝脂肪變性涉及的414個(gè)基因，并將這些基因歸成3類: 308個(gè)具有時(shí)間依賴效應(yīng)、9個(gè)具有劑量依賴效應(yīng)而其余97個(gè)具有時(shí)間、劑量雙重依賴效應(yīng)。具有時(shí)間依賴效應(yīng)的308個(gè)基因通常與主要脂類代謝顯著相關(guān)。進(jìn)一步報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)他莫昔芬抑制了5α-二氫睪酮介導(dǎo)的雄激素受體的激活和核受體亞家族2組F成員、肝細(xì)胞核因子4α、視黃酸受體相關(guān)孤兒受體α1的內(nèi)源性激活，從而產(chǎn)生肝脂肪變性的不良反應(yīng)。這些結(jié)果均表明，基因表達(dá)譜芯片對于藥物的毒性發(fā)現(xiàn)是一種高度敏感的方法。

2.4 用于藥物基因組學(xué)研究

藥物基因組學(xué)是功能基因組學(xué)和分子藥物學(xué)的結(jié)合，是研究藥物反應(yīng)的遺傳機(jī)制及藥物反應(yīng)的個(gè)體差異性的一門嶄新學(xué)科，起源于藥物遺傳學(xué)[35]。同一病癥的不同患者對同一種治療藥物常常出現(xiàn)不同的治療結(jié)果，這種現(xiàn)象的詳細(xì)研究對新藥開發(fā)和疾病治療是非常重要的。如果能預(yù)先判定腫瘤對化療藥物的敏感性，再測定患者的基因型，以判定機(jī)體對藥物的處置及反應(yīng)性，最后將二者結(jié)合起來判斷最終治療方案，則可能是一個(gè)有希望的基因組學(xué)新治療策略。藥物基因組學(xué)依賴于藥理學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)及基因組學(xué)上的方法和技術(shù)，其中特別需要高效的基因變異檢測方法，即從眾多的個(gè)體中獲得某等位基因產(chǎn)物檢查其變異并確定變異基因的序列變化，因此基因芯片在藥物基因組學(xué)中的地位是不言而喻的[35]。

基因組多態(tài)性，特別是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是指由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性[36]能充分反映個(gè)體間的遺傳差異。研究SNP與個(gè)體對藥物敏感性或耐受性差異的相關(guān)性，可以闡明遺傳因素對藥物作用的影響，從而指導(dǎo)合理的個(gè)體化用藥方案。目前有多種方法可檢測和識別SNP，例如限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析、等位基因特異的寡核苷酸雜交等，但這些方法在樣本的處理方面費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。理論上基因芯片可以提供足以檢出任何SNP的探針，檢測出基因組中的SNP。為此，一些公司和實(shí)驗(yàn)室正努力研制全基因組SNP的芯片。如 Affymetrix公司，新近開發(fā)了一個(gè)集成有1500個(gè)SNP的DNA芯片，稱HuSNP，它涵蓋了人類基因組22條常染色體和X染色體，檢測時(shí)可對DNA樣品進(jìn)行一次全基因組的掃描。這些都有希望使抗腫瘤領(lǐng)域發(fā)生有革命性的改變。

3 基因芯片技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用

3.1 基因芯片在腫瘤診斷中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，一些技術(shù)例如HE染色、免疫組化等被用于腫瘤的診斷和分型，但目前的這些技術(shù)都只是作為腫瘤病理形態(tài)學(xué)的輔助診斷工具。腫瘤是在分子水平上具有高度異質(zhì)性的疾病，病理形態(tài)學(xué)相近的腫瘤甚至同一種腫瘤的不同患者其分子遺傳學(xué)改變不盡相同。因此，腫瘤病理形態(tài)學(xué)診斷已不能滿足腫瘤診斷及分型的需要?；蛟\斷是使用分子生物學(xué)手段，通過檢測腫瘤相關(guān)基因的存在，分析腫瘤相關(guān)基因的缺陷及其表達(dá)和功能，達(dá)到腫瘤診斷及分型的目的，其基礎(chǔ)是核酸中堿基序列排列的特異性，因此比腫瘤病理形態(tài)學(xué)診斷更具有準(zhǔn)確性。傳統(tǒng)的基因診斷方法包括酶切，RFLP，變性HPLC(DHPLC)，直接測序等，這些方法或者不能定性，或者耗時(shí)費(fèi)力、所需設(shè)備和耗材昂貴，更重要的是這些方法難以同時(shí)對不同基因的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。因此有必要建立一種高通量、高效率的基因突變檢測方法，以實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測或大規(guī)模人群篩查。例如HE染色是常規(guī)病理檢查診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的通用方法，但漏診率卻高達(dá)20%[37]。常規(guī)病理檢查漏診的微小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶稱為淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移[34]。縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)預(yù)后的重要因素，縱隔淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移(隱匿性)導(dǎo)致了對TNM分期的低估，部分pNo肺癌預(yù)后不良可能與此有關(guān)[38]。黏蛋白1(mucoprotein 1，MUC1)基因是上皮組織特異性標(biāo)志物，在正常的肺、支氣管組織中均有表達(dá)，在NSCLC瘤組織中也保留MUC1基因的表達(dá)，但正常淋巴結(jié)中則無該基因的表達(dá)。應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測NSCLC患者的縱隔淋巴結(jié)中MUC1及其他已知的NSCLC中差異表達(dá)的基因群，則診出率將大幅提高。除此，Cui等[39]則利用基因芯片分析了54對胃癌患者癌變組織和相鄰的非癌變組織，成功建立了特定基因表達(dá)水平和胃癌等級之間的聯(lián)系，結(jié)果表明共有19個(gè)基因與胃癌等級密切相關(guān)，其總體精度可達(dá)79.6%；而有198基因可用于胃癌等級劃分。該實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了可用于癌癥等級劃分的基因標(biāo)志物，并顯示出了基因芯片技術(shù)在基因診斷中高通量的優(yōu)勢。

3.2 基因芯片在尋找腫瘤相關(guān)基因中的應(yīng)用

目前腫瘤是一種公認(rèn)的分子水平的疾病，它的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，是多種腫瘤相關(guān)基因表達(dá)失?；蚰[瘤抑制基因失活所致。要了解整個(gè)癌變過程中的基因改變，以及癌變在各個(gè)階段中細(xì)胞全部基因表達(dá)的動態(tài)變化，需要研究的不是一個(gè)或幾個(gè)基因，而是整個(gè)基因組在從正常到腫瘤的各個(gè)階段中上千個(gè)基因表達(dá)的動態(tài)變化。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法如差異顯示PCR、消減雜交、抑制性消減雜交等能以各自獨(dú)特的設(shè)計(jì)策略有效地發(fā)現(xiàn)一些腫瘤相關(guān)基因[40]，但這些方法大多局限于對單個(gè)或數(shù)個(gè)基因的分析，無法闡明腫瘤某一生物學(xué)過程或某一病理生理過程中眾多基因的復(fù)雜作用和相互間調(diào)控關(guān)系，且所得為基因序列片段，對一些低豐度的基因不易發(fā)現(xiàn)，同時(shí)還具有操作步驟繁瑣費(fèi)時(shí)、假陽性率較高、重復(fù)性差、特異性不高、低通量等不足，易受PCR、電泳分辨率等條件的限制。相反利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)則可以隨時(shí)獲取腫瘤細(xì)胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)基因的表達(dá)模式?；蛐酒夹g(shù)可直接檢測信使RNA(mRNA)的種類及豐度，是研究基因表達(dá)的強(qiáng)有力工具。例如，Zhang等應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析了CD133＋CD200＋和CD133－CD200－結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的基因表達(dá)差異[33]。通過分析共發(fā)現(xiàn)有655個(gè)基因在兩種細(xì)胞中的表達(dá)具有顯著差異(至少3倍)。其中，在CD133＋CD200＋細(xì)胞中有290種基因高表達(dá)，有365種基因低表達(dá)。之后的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MDM2，PRKACG及CACNA1G基因是CD133＋CD200＋特異表達(dá)的，并且這一點(diǎn)也得到了實(shí)時(shí)定量PCR的確定。此外，Richardson等[41]應(yīng)用具有54 000個(gè)寡核苷酸的基因芯片比較了前列腺癌腫瘤組織與主要的腫瘤微環(huán)境成分:腫瘤上皮、腫瘤相關(guān)基質(zhì)、正常上皮、正?；|(zhì)中基因表達(dá)差異。通過分析發(fā)現(xiàn)了44個(gè)為腫瘤相關(guān)基質(zhì)差異表達(dá)的基因，其中35個(gè)是在腫瘤上皮中發(fā)現(xiàn)的。意想不到的是，腫瘤相關(guān)基質(zhì)與正?；|(zhì)相比具有顯著增高的轉(zhuǎn)錄水平，然而腫瘤上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平相對于正常上皮細(xì)胞則顯著降低。這些數(shù)據(jù)證明基因芯片技術(shù)應(yīng)用于腫瘤相關(guān)基因研究，可以方便快速地縮小研究范圍，有效地篩選出目的基因進(jìn)行深入研究，具有很好的可行性。

4 展望

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多階段的復(fù)雜過程，通常是由于某些基因突變和異常表達(dá)所致。因此，對腫瘤生物學(xué)特征的研究應(yīng)從基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織等不同水平進(jìn)行。由于基因芯片(DNA芯片)可容納巨大數(shù)量的基因探針(可以是細(xì)胞全部基因探針)，應(yīng)用基因芯片技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行許多基因的檢測，可以從疾病和藥物兩個(gè)角度對生物體多個(gè)參量同時(shí)進(jìn)行研究，隨時(shí)獲取腫瘤細(xì)胞生長各期與腫瘤生長相關(guān)基因的表達(dá)模式。故將基因芯片技術(shù)運(yùn)用到涉及眾多基因改變的腫瘤研究中，可以更全面地了解腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為抗腫瘤藥物作用機(jī)制篩查、抗腫瘤藥物篩選、抗腫瘤藥物毒理學(xué)研究、藥物基因組學(xué)、腫瘤診斷、尋找腫瘤相關(guān)基因等各個(gè)抗腫瘤熱點(diǎn)領(lǐng)域提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

但基因芯片技術(shù)在抗腫瘤藥物研究中也存在如下一系列弊端。首先，DNA芯片上原位合成探針難以避免會有錯(cuò)誤核苷酸及雜質(zhì)混入，使背景信號過高，降低特異性；其次，Northern雜交出的差異基因經(jīng)基因芯片篩選會有漏檢；此外，由于缺乏足夠的生物信息學(xué)知識支持，目前正確的分析所得大量信息仍存在一定困難。由于在細(xì)胞中行使功能的是蛋白質(zhì)等成分，而由DNA到mRNA再到蛋白質(zhì)這個(gè)過程存在許多調(diào)控因素，因此僅僅明確DNA序列是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。某些情況下，細(xì)胞內(nèi)mRNA的含量并不與相應(yīng)蛋白質(zhì)的含量一致；蛋白質(zhì)可以通過磷酸化/去磷酸化等翻譯后修飾改變其生物學(xué)活性。蛋白質(zhì)芯片可以部分解決這方面的問題。

另外，基因芯片昂貴的價(jià)格導(dǎo)致樣本量無法擴(kuò)大，難以進(jìn)行傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)分析仍是目前限制它廣泛應(yīng)用的最主要原因。

[1] Luo J，Solimini NL，Elledge SJ.Principles of cancer therapy:oncogene and non-oncogene addiction [J].Cell，2009，136(5):823-837.

[2] Sporn MB，Suh N.Chemoprevention:an essential approach to controlling cancer[J].NatRev Cancer，2002，2(7):537-543.

[3] Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013[J].CA Cancer J Clin，2013，63(1):11-30.

[4] Mi F.One of five people in our country may be suffering from cancer[J].China Youth Stud(中國青年研究)，2013，(5):117-119.

[5] Georgoulias V， Crown JP.Increasing options in cancer therapy:current status and future prospects [J].Anticancer Drugs，1999，10(Suppl 1):S1-S3.

[6] Ding J.New research approaches in anti-tumor drug[J].Chin New Drugs J(中國新藥雜志)，2000，9(3):149-154.

[7] Lee DW，Choi YS，Seo YJ，Lee MY，Jeon SY，Ku B，et al.High-throughput screening(HTS)of anticancer drug efficacy on a micropillar/microwell chip platform[J].Anal Chem，2014，86(1):535-542.

[8] Brentani RR，Carraro DM，Verjovski-Almeida S，Reis EM，Neves EJ，de Souza SJ，et al.Gene expression arrays in cancer research:methods and applications[J].Crit Rev Oncol Hematol，2005，54(2):95-105.

[9] Li CC，Li HY，Hsiang CY，Ho TY.DNA microarray analysis as a tool to investigate the therapeutic mechanisms and drug development of Chinese medicinal herbs[J].Biomededine，2012，2(1):10-16.

[10] Dubey PP， Kumar D.Microarray Technology: basic concept，protocols，and applications[M]∥Kumar DA.Analyzing Microbes.Berlin:Springer Berlin Heidelberg，2013:261-279.

[11] Basso K，Klein U.Gene expression profile analysis of lymphomas[M]∥Lymphoma.Methods in Molecular Biology.New Jersey:Humana Press，2013:213-226.

[12] Wang JJ， Hou PQ.Gene chip technology[J]. Prev Med Trib(預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇)，2008，14(3):285-287.

[13] Zhu T.Global analysis of gene expression using GeneChip microarrays[J].Curr Opin Plant Biol，2003，6(5):418-425.

[14] Ohr H，Bui AQ，Le BH，F(xiàn)ischer RL，Choi Y.Identification of putative Arabidopsis DEMETER target genes by GeneChip analysis[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，364(4):856-860.

[15] Nagarajan R，Upreti M.Qualitative assessment of gene expression in affymetrix genechip arrays[J]. Physica A:Statist Theor Phys，2007，373(1): 486-496.

[16] Chen Z，Zeng ZF.The new development of gene chip technology[J].J Int Lab Med(國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)，2006，27(3):249-251.

[17] Duftner N，Larkins-Ford J，Legendre M，Hofmann HA. Efficacy of RNA amplification is dependent on sequence characteristics: implications forgene expression profiling using a cDNA microarray[J]. Genomics，2008，91(1):108-117.

[18] Pasquini G，Barba M，Hadidi A，F(xiàn)aggioli F，Negri R，Sobol I，et al.Oligonucleotide microarray-based detection and genotyping of plum pox virus[J].J Virol Methods，2008，147(1):118-126.

[19] Chen Z，Liu Q，McGee M，Kong M，Huang X，Deng Y，et al.A gene selection method for Gene-Chip array data with small sample sizes[J].BMC Genomics，2011，12(Suppl 5):S7.

[20] Su Z，Xia J，Zhao Z.Functional complementation between transcriptional methylation regulation and post-transcriptionalmicroRNA regulation in the human genome[J].BMC Genomics，2011，12 (Suppl 5):S15.

[21] Raspe E，Decraene C，Berx G.Gene expression profiling to dissect the complexity of cancer biology: pitfalls and promise[J].Semin Cancer Biol，2012，22(3):250-260.

[22] Liu X，Liu J，Xu X，Chun L，Tang J，Deng Y.A robust detail preserving anisotropic diffusion for speckle reduction in ultrasound images[J].BMC Genomics，2011，12(Suppl 5):S14.

[23] Venkataraman B，Vasudevan M，Gupta A.A new microarray platform for whole-genome expression profiling ofMycobacterium tuberculosis[J].J Microbiol Methods，2014，97:34-43.

[24] Young RA.Biomedical discovery with DNA arrays [J].Cell，2000，102(1):9-15.

[25] Scher HI，Heller G.Clinical states in prostate cancer: toward a dynamic model of disease progression [J].Urology，2000，55(3):323-327.

[26] Catalona WJ，Smith DS，Ratliff TL，Basler JW. Detection of organ-confined prostate cancer is increased through prostate-specificantigen-based screening[J].JAMA，1993，270(8):948-954.

[27] Stenman UH，Leinonen J，Zhang WM，F(xiàn)inne P. Prostate-specific antigen[C]∥Michael KB，Roger K.Seminars in Cancer Biology.Helsinki:Academic Press，1999，9(2):83-93.

[28] Liotta L，Petricoin E.Molecular profiling of human cancer[J].Nat Rev Genet，2000，1(1):48-56.

[29] Welsh JB，Sapinoso LM，Su AI，Kern SG，Wang-Rodriguez J，Moskaluk CA，et al.Analysis of gene expression identifies candidate markers and pharmacological targets in prostate cancer[J].Cancer Res，2001，61(16):5974-5978.

[30] Scherf U，Ross DT，Waltham M，Smith LH，Lee JK，Tanabe L，et al.A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer[J].Nat Genet，2000，24(3):236-244.

[31] Blohm DH，Guiseppi-Elie A.New developments in microarray technology[J].Curr Opin Biotechnol，2001，12(1):41-47.

[32] Ushijima M，Mashima T，Tomida A，Dan S，Saito S，F(xiàn)uruno A， etal.Developmentofa gene expression database and related analysis programs for evaluation of anticancer compounds[J].Cancer Sci，2013，104(3):360-368.

[33] Yao L，Jin QY，Xie H，Hu WL，Chen LJ.Application of gene chip in drug study[J].Acta Acad Med CPAF(武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2009，18(7):646-649.

[34] Lee MH，Kim JW，Kim JH，Kang KS，Kong G，Lee MO.Gene expression profilingofmurine hepatic steatosis induced by tamoxifen[J].Toxicol Lett，2010，199(3):416-424.

[35] Afshari CA，Nuwaysir EF，Barrett JC.Application of complementary DNA microarray technology to carcinogen identification， toxicology， and drug safety evaluation[J].Cancer Res，1999，59(19): 4759-4760.

[36] Kallioniemi OP.Biochip technologies in cancer research[J].Ann Med，2001，33(2):142-147.

[37] Waring JF， Jolly RA， Ciurlionis R， Lum PY，Praestgaard JT，Morfitt DC，et al.Clustering of hepatotoxins based on mechanism of toxicity using gene expression profiles[J].Toxicol Appl Pharmacol，2001，175(1):28-42.

[38] Evans WE， Relling MV. Pharmacogenomics: translating functional genomics into rational therapeutics[J].Science，1999，286(5439):487-491.

[39] Cui J，Li F，Wang G，F(xiàn)ang X，Puett JD，Xu Y. Gene-expression signatures can distinguish gastric cancer grades and stages[J].PLoS One，2011，6 (3):e17819.

[40] Sheng YP，Zheng LZ，Chen Q，Guo WJ，Li JF，Liu BY，et al.Establishment and selection of genes expressing differently in a human coIon carcinoma LoVo/5-FU cell line[J].World Chin J Digestol(世界華人消化雜志)，2007，15(17):1899-1904.

[41] Richardson AM，Woodson K，Wang Y，Rodriguez-Canales J，Erickson HS，Tangrea MA，et al.Global expression analysis of prostate cancer-associated stroma and epithelia[J].Diagn Mol Pathol，2007，16(4):189-197.

AppIications of genechip technoIogy in antineopIastic and cancer treatment

CAO Ming-nan1，CUI Jun2，LI Wei-dong3
(1.Department of Chemical Biology，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China；2.Department of Pediatric Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；3.Department of Pharmacology，School of Basic Medical Sciences，Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China)

Tumorigenesis is the combined effect of environmental and genetic factors on organisms，causing activation of multiple oncogenes，inactivation of tumor suppressor genes through a multistep，mutagenic process whereby cells undergo a series of physiological changes including regulation of apoptosis and repairs of DNA damages.Gene chip technology is an emerging molecular biology technique developed in the mid-1990s.It has high-throughput，multifactorial，miniaturized，sensitive，quick and other characteristics in genetic analyses.Application of these features in tumor research which involves a number of genetic changes could shed much light on tumor development so as to facilitate diagnosis and treatment of tumors.In this paper，progress in gene chip technology for screening antitumor drug reaction mechanisms and antitumor drugs，toxicology of antitumor drugs，pharmacogenomics，tumor diagnosis and the search for tumor related genes were reviewed.

oligonucleotide array sequence analysis；antineoplastic drugs；therapeutic uses

LI Wei-dong，Tel:13641280216，E-mail:lwdpharma＠126.com

R965.1

:A

:1000-3002(2014)06-0932-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.017

2014-01-04 接受日期:2014-08-19)

(本文編輯:喬 虹)

曹明楠(1989－)，研究生，博士，主要從事重大慢性疾病的化學(xué)預(yù)防研究。

李衛(wèi)東，E-mail:lwdpharma＠126.com，Tel:13641280216