馬鼻肺炎診斷方法研究進(jìn)展

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（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州 510623；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

馬鼻肺炎診斷方法研究進(jìn)展

魚海瓊1，張 樹2，林志雄1，羅長保1，趙 吟1，田純見1，李守軍2

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州 510623；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

馬鼻肺炎的病原是馬皰疹病毒l型和馬皰疹病毒4型，屬于皰疹病毒目，皰疹病毒科，a皰疹病毒亞科，通常會引起呼吸道疾病和病毒性流產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)神經(jīng)性疾病。該病毒在世界范圍內(nèi)流行，對養(yǎng)馬業(yè)和賽馬業(yè)的危害很大。本文總結(jié)國內(nèi)外近些年關(guān)于馬皰疹病毒的病原學(xué)和血清學(xué)診斷方法的研究成果，了解國際上關(guān)于馬鼻肺炎檢測診斷方法的研究進(jìn)展，為出入境賽馬的馬鼻肺炎的檢驗(yàn)檢疫提供可靠的檢測方法。

馬鼻肺炎；診斷方法 ；研究進(jìn)展

1 前言

馬鼻肺炎是由馬皰疹病毒l型（Equineherpesvirus1，EHV-l）和馬皰疹病毒4型（Equineherpesvirus4，EHV-4）引起的以呼吸道癥狀、妊娠馬流產(chǎn)、胎兒死亡以及少見的神經(jīng)癥狀等為特征的傳染性疾病[1]。EHV-1和EHV-4能夠在馬群內(nèi)廣泛的傳播并且潛伏感染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是養(yǎng)馬業(yè)健康發(fā)展的巨大威脅[2]。也出現(xiàn)EHV-1感染非馬屬動(dòng)物的個(gè)別病例，如感染牛引起流產(chǎn)、美洲駝引起視神經(jīng)疾病和失明、瞪羚引起腦炎等[3]。目前，尚無證據(jù)證明這兩種皰疹病毒對人有感染性[3]。EHV-1/4感染引起的呼吸道感染，雖說可造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，但巨大的威脅卻是由此給種馬、賽馬或娛樂馬帶來的潛在的流產(chǎn)和神經(jīng)疾患后遺癥。因此，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）《國際動(dòng)物衛(wèi)生法典》將馬鼻肺炎列入法定報(bào)告疾病名錄[4]，多數(shù)國家已將本病列為養(yǎng)馬業(yè)重點(diǎn)防治疫病之一。我國農(nóng)業(yè)部也將馬鼻肺炎列為二類動(dòng)物傳染病，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局與其他國家簽訂的檢疫條款中也將其列為出入境馬屬動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫的疫病之一[3]。

EHV-1/4具有皰疹病毒甲亞科獨(dú)特的生物學(xué)特性，導(dǎo)致其相應(yīng)的流行病學(xué)特征：雖然青年馬普遍易感，但臨床發(fā)病率低；潛伏感染帶毒馬比例高；帶毒馬經(jīng)常排出傳染性病毒子，不間斷地傳播給新一代易感動(dòng)物[3]。EHV-1/4感染的發(fā)病馬和潛伏感染再次激活的亞臨床排毒馬，通過鼻腔分泌物、糞便和流產(chǎn)時(shí)的胎兒、胎膜以及胎液等向外界排毒[5]，成為重要的傳染源。病毒可以通過呼吸道、消化道進(jìn)行水平傳播，也可以通過感染的妊娠母馬進(jìn)行垂直傳播，可呈地方性流行，多發(fā)生于秋冬和早春[6]。在馬群內(nèi)，各個(gè)階段的馬對EHV1/4都易感，但是往往產(chǎn)生不同的臨床癥狀，斷奶前后的馬駒容易感染產(chǎn)生明顯的呼吸道癥狀，育成馬初次感染一般會有明顯的臨床癥狀，并且對再次感染具有一定的免疫力，妊娠母馬感染后則主要引起流產(chǎn)[7]。

據(jù)文獻(xiàn)記載，本病最早發(fā)現(xiàn)于美國，隨后是歐洲和其余各大洲，已發(fā)現(xiàn)于40多個(gè)國家或地區(qū)[8]。一些亞洲國家如日本、俄羅斯、印度、馬來亞等均有報(bào)道。血清學(xué)調(diào)查顯示，許多國家和地區(qū)的大多數(shù)成年馬等馬屬動(dòng)物存在EHV-1/4抗體，說明EHV-1/4廣泛分布于世界馬群，從檢查血清抗體反應(yīng)來看，有些地區(qū)感染率高達(dá)90%[8]。多數(shù)研究者認(rèn)為，世界有馬的地區(qū)都有本病存在，在大量養(yǎng)馬的國家呈地方性流行，多年來一直對世界養(yǎng)馬業(yè)形成威脅[4]。

近些年來，據(jù)世界范圍內(nèi)報(bào)道，神經(jīng)型EHV-1引起的疾病出現(xiàn)頻率上都呈上升趨勢。Goehring等[9]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，EHV-1所致馬腦脊髓炎是荷蘭馬最常見的神經(jīng)性疾病。到目前為止，報(bào)道的最嚴(yán)重的一次馬腦脊髓炎暴發(fā)于2003年發(fā)生在美國俄亥俄州的一個(gè)大學(xué)馬術(shù)中心，導(dǎo)致34%的馬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死亡率高達(dá)30%[10]。最近，由EHV-1引起的麻痹癥或腦脊髓炎不斷在美國乃至世界范圍內(nèi)的賽道、馬展會和獸醫(yī)院中出現(xiàn)，因此被美國農(nóng)業(yè)部列為正在出現(xiàn)的疾病之一[8]。

2 國內(nèi)外馬鼻肺炎診斷方法研究進(jìn)展

2.1病原學(xué)診斷方法

2.1.1馬皰疹病毒的分離和鑒定

目前，馬鼻肺炎的診斷一般采用血清學(xué)方法以及病毒分離鑒定[19]。病原分離鑒定是實(shí)驗(yàn)室診斷EHV-1/4的重要標(biāo)準(zhǔn)。采集感染馬發(fā)熱期的鼻咽拭子、血液白細(xì)胞或是流產(chǎn)胎兒的組織，樣品經(jīng)過迅速的處理后將病毒液接種到馬源細(xì)胞上均可分離到病毒。EHV-1/4在細(xì)胞培養(yǎng)物上形成典型的細(xì)胞病變，如細(xì)胞圓縮、脫落和聚集呈葡萄串狀等[11]。分離的病毒可以用直接免疫熒光的方法進(jìn)行鑒定，以達(dá)到準(zhǔn)確分型的目的。

我國在1980年由劉景華等[12]從東北兩個(gè)馬場的流產(chǎn)胎兒中首次分離到馬鼻肺炎病毒，經(jīng)鑒定為馬皰疹病毒，從而證明多年來流行于我國的母馬流產(chǎn)，除沙門菌性流產(chǎn)外，有病毒性流產(chǎn)的存在。之后，新疆野馬繁殖中心暴發(fā)過馬鼻肺炎，導(dǎo)致馬群100%感染，懷孕的12匹母馬有8匹流產(chǎn)，有1匹產(chǎn)下弱駒，弱駒于24h內(nèi)死亡。在8匹流產(chǎn)胎兒中，懷孕早期的就有5匹，流產(chǎn)和弱駒死亡率達(dá)到80%。單文魯?shù)萚13]從流產(chǎn)胎兒中分離病毒經(jīng)PCR鑒定為EHV-1。

國外對馬鼻肺炎病毒的研究起步較早，在20世紀(jì)60年代對病毒進(jìn)行全面鑒定，認(rèn)識到了馬鼻肺炎是由皰疹病毒引起的。不少學(xué)者通過對不同毒株的特性比對分析，將鼻肺炎病毒劃分為兩個(gè)亞型（胎兒亞型和呼吸亞型），到1986年將這兩個(gè)亞型正式更名為EHV-1（胎兒亞型）和EHV-4（呼吸亞型）。從20世紀(jì)90年代開始，隨著生物技術(shù)的快速進(jìn)步，對EHV-1/4的研究也進(jìn)入了快速發(fā)展階段，在1992年，就完成了EHV-1全基因組的測序，EHV-4全基因組的測序也隨后完成，EHV-1/4的研究進(jìn)入了分子階段。

2.1.2聚合酶聯(lián)反應(yīng)

聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）靈敏性強(qiáng)、耗時(shí)短、操作簡便，可以進(jìn)行大規(guī)模檢測，適合于大量樣品的篩選性檢測；而且PCR直接檢測精液和鼻咽分泌物，不存在散毒的危險(xiǎn)，適合在基層單位推廣應(yīng)用。Lawrence等[14]最早建立了EHV-1/4快速PCR檢測方法?；贓HV-1和EHV-4基因序列之間的差異性進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)在EHV-1/4快速診斷中具有重要作用。目前已經(jīng)建立了多種PCR方法進(jìn)行EHV-1和EHV-4的分型檢測，如多重PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)[8]、熒光定量PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)等。

2.1.3基因芯片

基因芯片（Gene Chip）又稱DNA芯片（DNA chip）或基因微矩陣（DNA Microarry）是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的前沿生物技術(shù)，由于基因芯片高速度、高通量、集約化等方面的特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于表達(dá)譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等領(lǐng)域，并開始在腫瘤、遺傳病和傳染病的檢測方面發(fā)揮其優(yōu)越性。朱來華等[15]建立基因芯片技術(shù)，是國內(nèi)外首次開發(fā)可以在一次試驗(yàn)中同時(shí)快速檢測和區(qū)分EHV-1、EAV、EIV、EIAV、EEEV等5種馬病毒，具有快速、特異、高通量的特點(diǎn)，可應(yīng)用于大規(guī)模出入境馬屬動(dòng)物的快速檢測和鑒別診斷。

2.1.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一種嶄新的DNA擴(kuò)增方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）引起了世人的矚目[16]，該方法主要是利用4種特異性引物（F3、B3、FIP和BIP）識別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，通過一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等溫條件（60～65℃）保溫30～60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長時(shí)間溫度循環(huán)、煩瑣的電泳、紫外觀察等過程。目前，LAMP已在臨床病原微生物檢測、遺傳病診斷、SNP分型、傳染病檢測和轉(zhuǎn)基因食品鑒定等領(lǐng)域顯示出了巨大的應(yīng)用潛力并正得到日益廣泛的應(yīng)用。

2010年，Nemoto等[16]根據(jù)EHV-1和EHV-4的gC和gE基因上保守序列，利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，且可在等溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?；虻臄U(kuò)增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴(kuò)增效率高。這為馬皰疹病毒的臨床檢測提供了一種簡便、實(shí)用的方法。之后，Nemoto等[14]通過增加樣品熱處理的步驟來提高LAMP的靈敏度。熱處理可以提高LAMP的檢測極限，比普通的LAMP敏感性提高10倍，甚至可以省略DNA抽提的步驟。此外，熱處理的LAMP比原來的LAMP和PCR更敏感。通過熱處理的LAMP更容易操作，更適合應(yīng)用于EHV-1的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷[14]。

2.2血清學(xué)診斷方法

馬鼻肺炎血清學(xué)方法主要包括中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA。常規(guī)的血清學(xué)試驗(yàn)（如中和試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)）常出現(xiàn)交叉反應(yīng)，不能區(qū)分EHV-1/4。因此開發(fā)型特異單克隆抗體阻斷ELISA，熒光技術(shù)或重組型特異性抗原包被的ELISA等[13]血清學(xué)技術(shù)檢測和區(qū)分EHV-1/4抗體正是國際上科研工作者的研究重點(diǎn)。朱來華等[15]建立微量血清中和試驗(yàn)，為出入境馬屬動(dòng)物檢疫建立了一套標(biāo)準(zhǔn)的、特異的、靈敏的馬鼻肺炎診斷試劑和標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，填補(bǔ)了國內(nèi)空白。（但中和試驗(yàn)也存在一些缺點(diǎn)，如耗時(shí)長、操作煩瑣；在操作過程中需要活的細(xì)胞和病毒，而細(xì)胞、病毒保存需要超低溫條件，而且存在病毒散播的潛在威脅）[20]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA ）靈敏性強(qiáng)、耗時(shí)短、操作簡便，可以進(jìn)行大量樣品的篩選性檢測，適合在基層單位推廣應(yīng)用。B.S.Crabb等[11]在1995年建立一種可以區(qū)分EHV-1/4抗體的型特異性ELISA檢測技術(shù)，該技術(shù)是基于gG基因中的一段型特異性抗原表位基因進(jìn)行設(shè)計(jì)的，截取EHV1/4 gG基因中的型特異性抗原表位基因區(qū)段，融合表達(dá)后這段基因序列表達(dá)的蛋白具有良好的型特異性抗原表位，可以和馬血清中的EHV-1/EHV-4 gG抗體發(fā)生特異性的反應(yīng)。該技術(shù)的建立使得能夠從血清學(xué)方面完成EHV-1和EHV-4感染的分型鑒定，對廣泛的流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。而在國內(nèi)，陶虹用差速離心和蔗糖密度梯度提純EHV-1，作為包被抗建立了馬鼻肺炎間接ELISA診斷方法。朱來華[15]利用原核重組型共同gD建立間接ELISA檢測馬鼻肺炎抗體。2010年，鄭小龍等[19]以基因重組抗原包被96孔板，Eu3+標(biāo)記兔抗馬IgG，建立了馬病毒性動(dòng)脈炎和鼻肺炎抗體的時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測方法。這些方法交叉反應(yīng)不明顯，特異性好，靈敏度高，具有很好的應(yīng)用前景。

總體來說，EHVGD-ELISA是一種快速、靈敏的檢測技術(shù)，正在成為許多動(dòng)物貿(mào)易檢疫條款最常用的方法；中和試驗(yàn)是經(jīng)典的檢測方法，一直是OIE指定的最常用檢測技術(shù)，是最終的驗(yàn)證手段；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)在動(dòng)物感染的早期階段具有重要的診斷價(jià)值，是最有參考價(jià)值的血清學(xué)方法。

3 小結(jié)

我國關(guān)于馬皰疹病毒的研究已有30多年的歷史，一直以來，無數(shù)學(xué)者前仆后繼、孜孜不倦的研究，為我國馬皰疹病毒的診斷留下了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和珍貴的資料。先后建立了ELISA、PCR、rt-PCR等多種實(shí)用的檢測方法[3，15，19-20]，為我國馬皰疹病毒的檢測檢疫做出的重大貢獻(xiàn)。在疾病檢測中，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)樣品的種類選擇快速的實(shí)驗(yàn)室方法，如從組織、血液、拭子、流產(chǎn)胎兒等樣品做PCR、組織樣品做免疫熒光染色、抗體用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA篩選，進(jìn)行初步診斷，然后再進(jìn)行確診試驗(yàn)，如病毒分離、組織病理學(xué)、免疫組化染色以及中和試驗(yàn)等方法。

在臨床實(shí)踐中，我們可根據(jù)流行病學(xué)、臨診癥狀、流產(chǎn)胎兒病變，尤其是嗜酸性核內(nèi)包涵體等，對馬鼻肺炎做出初步診斷。但EHV-1/4感染引起的馬鼻肺炎常常容易與其他病原導(dǎo)致的上呼吸道感染、流產(chǎn)或神經(jīng)性疾病相混淆[16]，不能僅僅依賴于臨床癥狀來診斷，還需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)行確診。一些快速而先進(jìn)的診斷技術(shù)，如ELISA、PCR、免疫組化法、直接免疫熒光技術(shù)等都有報(bào)道[15，19-20]，但因?yàn)樗鼈兊膽?yīng)用受實(shí)驗(yàn)室條件限制，所以采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病原后再進(jìn)行血清型鑒定等傳統(tǒng)方法仍然是經(jīng)典的診斷技術(shù)。但由于這些常規(guī)方法需花費(fèi)很長時(shí)間才能完成對馬鼻肺炎的鑒定，檢出率低、重復(fù)性差，況且還需要嚴(yán)格的培養(yǎng)條件以及實(shí)驗(yàn)室操作存在潛在的危險(xiǎn)性。因此，迫切需要建立馬鼻肺炎的新型、快捷、可靠、簡便、適合臨床應(yīng)用的檢測技術(shù)。

近些年來，據(jù)世界范圍內(nèi)報(bào)道，神經(jīng)型EHV-1引起的疾病出現(xiàn)頻率上都呈上升趨勢，給養(yǎng)馬業(yè)造成的損失越來越大[2]。國內(nèi)尚未見到對EHV-1進(jìn)行的系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，而且我國關(guān)于神經(jīng)型EHV-1的報(bào)道研究更是少之又少，這可能會成為我國養(yǎng)馬業(yè)的一個(gè)潛在威脅。

廣州成功舉辦2010年亞運(yùn)會，其中馬術(shù)比賽是亮點(diǎn)，許多價(jià)值昂貴的參賽馬匹來廣州參賽，疾病的檢測是重點(diǎn)。未來，中國將舉辦越來越多的國際性馬術(shù)比賽，而讓來自不同國家的名貴參賽馬匹健康來參賽，賽后順利回去，是我們要解決的問題。

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Research Advance of Equine Rhinopneumonitis Diagnosis Method

Yu Haiqiong1，Zhang Shu2，Lin Zhixiong1，Luo Changbao1，Zhao Yin1， Tian Chunjian1，Li Shoujun2
（1. Technical Center，Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510623；2. College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

Equine rhinopneumonitis is caused by equine herpesvirus 1 or equine herpesvirus 4，generally resulting in respiratory disease，abortions and neurological disorders in horses. The disease is distributed the world wide and cause great harms for horse farming and racing industry. This article introduces the research development of the rapid diagnosis method for equine herpesvirus at home and abroad，especilly the world advanced rapid diagnosis method，in an attempt to establish a rapid diagnosis method which could be used for the detection of equine rhinopneumonitis in export and import inspection.

Equine rhinopneumonitis； diagnosis method； research advance

S854.4

：A

：1005-944X（2014）02-0049-04

國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目2012IK006、廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目2011GDK53