乳腺癌基因組學(xué)研究進(jìn)展*

張柏林 宋豐舉

乳腺癌是全球女性發(fā)病和死亡占第1位的惡性腫瘤［1］。一般認(rèn)為，乳腺癌的發(fā)病是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果。體細(xì)胞突變是乳腺癌發(fā)生的必然途徑。體細(xì)胞突變分為遺傳性突變和獲得性突變。前者不是癌癥發(fā)生所必需的，而后者則由環(huán)境暴露刺激形成，在體內(nèi)逐漸累積，最終引發(fā)癌癥［2］。因此，研究腫瘤體細(xì)胞突變譜對(duì)于明確癌癥的成因和進(jìn)展過(guò)程有重要意義。二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)加速了癌癥基因組學(xué)研究的進(jìn)程，乳腺癌的基因組學(xué)研究也隨之取得了突破性進(jìn)展［3］。二代測(cè)序技術(shù)在腫瘤基因組學(xué)研究中的應(yīng)用可以歸納為4個(gè)方面：1）發(fā)現(xiàn)新的突變基因和通路；2）識(shí)別特異性突變簽名；3）探索腫瘤的克隆進(jìn)化；4）促進(jìn)個(gè)體化醫(yī)學(xué)發(fā)展［4］。本文就二代測(cè)序技術(shù)在乳腺癌基因組學(xué)中的研究成果進(jìn)行綜述。

1 突變基因與通路

在基因組變異與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)程度中，乳腺癌相關(guān)變異可分為常見(jiàn)低風(fēng)險(xiǎn)變異（5%～20%風(fēng)險(xiǎn)）、低頻中等風(fēng)險(xiǎn)變異（2～3倍風(fēng)險(xiǎn)）和罕見(jiàn)高風(fēng)險(xiǎn)變異（可達(dá)10倍風(fēng)險(xiǎn)）［5］。以往的關(guān)聯(lián)研究多集中在高頻率（＞5%）的SNP位點(diǎn)，在大量開(kāi)展全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）之后，“常見(jiàn)疾病-常見(jiàn)變異”的理論受到了極大的挑戰(zhàn)。因GWAS發(fā)現(xiàn)的癌癥相關(guān)SNP位點(diǎn)只能解釋5%～10%的癌癥病因，而大部分病因很可能歸于大量的罕見(jiàn)變異的作用［5-6］。因此，“常見(jiàn)疾病-罕見(jiàn)變異”的假說(shuō)產(chǎn)生。在罕見(jiàn)變異中尋找病因是更大的挑戰(zhàn)，檢測(cè)低頻變異需要更大的樣本量，更專(zhuān)業(yè)的技術(shù)平臺(tái)和更龐大的數(shù)據(jù)分析工作。在大量的低頻體細(xì)胞突變中，只有小部分是對(duì)癌癥發(fā)生有直接作用的“駕駛員”突變，而大部分只是“乘客”突變［7］。只有在大量突變中去偽存真，找到真正的駕駛員突變才能確定病因，以這些可操作突變?yōu)橐罁?jù)指導(dǎo)臨床開(kāi)發(fā)出有效的個(gè)體化治療手段。

近期開(kāi)展的乳腺癌二代測(cè)序技術(shù)報(bào)道了乳腺癌相關(guān)體細(xì)胞突變譜。Shah等［8］分別在80和65例三陰乳腺癌（雌激素受體、孕激素受體和Her-2受體均不表達(dá)）患者中進(jìn)行RNA和DNA測(cè)序。Ellis等［9］對(duì)77例雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者進(jìn)行DNA測(cè)序（46例全基因組測(cè)序和31例外顯子組測(cè)序）。另有研究分別對(duì)100和108例各種類(lèi)型乳腺癌進(jìn)行DNA測(cè)序，前者全部是全基因組測(cè)序，后者包括17例全基因組與外顯子組測(cè)序、5例全基因組測(cè)序以及86例外顯子組測(cè)序［10-11］。該研究常見(jiàn)的體細(xì)胞突變基因（＞10%）較少，只有TP53、PTEN和PIK3CA等，而大量存在的是低頻散發(fā)突變，包括TBX3、RUNX1、CBFB、AFF2、PIK3R1、PTPN22、PTPRD、NF1、SF3B1和CCND3等。這些突變單個(gè)作用有限，一般可歸納為特定的通路。某些突變具有互斥性特點(diǎn)，即兩種突變一般不會(huì)同時(shí)發(fā)生，如TP53和PIK3CA，前者傾向于發(fā)生在ER陰性患者，而后者多發(fā)生在ER陽(yáng)性患者。一些突變可能與抗癌治療的反應(yīng)和耐藥有關(guān)，Ellis等［9］認(rèn)為GATA3突變可能與芳香酶抑制劑治療抑制增殖作用有關(guān)。但在一些類(lèi)型的乳腺癌中無(wú)明顯的駕駛員突變，說(shuō)明可能有不同的機(jī)制驅(qū)動(dòng)這些腫瘤的發(fā)生，如DNA甲基化等。

通路反映了體細(xì)胞突變的共同作用。在乳腺癌中目前共總結(jié)了19個(gè)相關(guān)通路，主要包括PI3K/AKT信號(hào)通路、JUN/MAPK通路、凋亡通路、細(xì)胞周期通路、TP53信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、黏著斑通路、JAK/STAT信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路等［12］。其中，PI3K/AKT信號(hào)通路和JUN/MAPK通路被認(rèn)為是最重要的2個(gè)通路。突變?cè)谀承┩返母患f(shuō)明盡管腫瘤具有遺傳學(xué)差異，但由于共同通路的突變而在表型上具有相似性，對(duì)治療非常重要?？傊?，突變基因和通路的發(fā)現(xiàn)增加了對(duì)乳腺癌及其驅(qū)動(dòng)事件的認(rèn)知。此外，應(yīng)該開(kāi)展功能分析作為癌癥基因組結(jié)構(gòu)分析的補(bǔ)充，以證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)意義。

2 突變簽名

乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是多基因、多階段的過(guò)程，也是體細(xì)胞突變的積累過(guò)程，而不同的突變過(guò)程都會(huì)在基因組內(nèi)留下痕跡，即突變簽名（mutational signature）［13］。識(shí)別癌癥的體細(xì)胞突變簽名有助于加深對(duì)癌癥生物學(xué)的認(rèn)識(shí)。癌癥基因組中的體細(xì)胞突變可能來(lái)源于多個(gè)方面，如DNA修復(fù)機(jī)制的輕度失真、內(nèi)源性或外源性突變?cè)谋┞丁⒚复貲NA修飾或DNA修復(fù)缺陷等。不同的腫瘤具有各自特征性的突變簽名，有些突變簽名反映了環(huán)境因素的作用，如吸煙或?qū)е缕つw癌的紫外線(xiàn)照射等［14］。有些突變簽名則反映了DNA維護(hù)異常，如某些大腸癌中發(fā)現(xiàn)的DNA錯(cuò)配修復(fù)異常等［15］。通過(guò)二代測(cè)序分析可以全面揭示遺傳與環(huán)境變化在癌癥基因組內(nèi)留下的簽名。

乳腺癌基因組的堿基突變率低于其他常見(jiàn)成人惡性腫瘤，每1 000個(gè)堿基約有1個(gè)突變。黑色素瘤和肺鱗狀細(xì)胞癌的突變頻率最高，為乳腺癌的10倍。高頻率的突變可能反映了環(huán)境因素，如紫外線(xiàn)照射和吸煙等在這2種癌中的作用。在目前確定的全部21種腫瘤突變簽名中，各種腫瘤基因組攜帶的突變簽名從2種到6種不等，乳腺癌中目前確定的突變簽名主要有5種［13］。這些突變簽名有的與年齡有關(guān)，如最常見(jiàn)的簽名1B，發(fā)生在60%的腫瘤樣本中；有的簽名（如簽名3）與BRCA1/2突變有關(guān)，是典型的乳腺癌特異性簽名，只出現(xiàn)在乳腺癌、卵巢癌等少數(shù)幾種腫瘤中；另外有2個(gè)簽名（簽名2和簽名13）與APOBEC有關(guān)，其中簽名2發(fā)生頻率為15%，主要特征是TpCpG三核苷酸序列上的C＞T和C＞G突變，與APOBEC胞苷脫氨酶家族成員的過(guò)度活性有關(guān)，在堿基切除修復(fù)和DNA復(fù)制機(jī)制的共同作用下，使胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶。乳腺癌相關(guān)簽名8僅發(fā)生在約2%的腫瘤樣本中，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚［13］。在乳腺癌特征性的突變簽名中，并無(wú)與環(huán)境暴露明確相關(guān)的簽名，這與宏觀流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)基本一致。

此外，二代測(cè)序技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了2種新的突變簽名，即雷雨（kataegis）［16］和染色體破碎（chromothripsis）［17］。雷雨是指與結(jié)構(gòu)變異共存的體細(xì)胞單核苷酸變異集群。染色體破碎是指由單個(gè)的染色體破碎重組事件導(dǎo)致的復(fù)雜的體細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異，特征是拷貝數(shù)波動(dòng)和染色體局部大量重排。研究者在乳腺癌14號(hào)染色體區(qū)域發(fā)現(xiàn)密集（多于50個(gè)突變）雷雨簽名［13］，反映了該區(qū)域基因組重排的特征。

3 瘤內(nèi)異質(zhì)性

乳腺癌二代測(cè)序研究中最意外的發(fā)現(xiàn)是每個(gè)腫瘤樣本的測(cè)序結(jié)果均不重復(fù)，突變譜差異極大，這種個(gè)性化的結(jié)果被稱(chēng)為腫瘤的異質(zhì)性［18］。腫瘤異質(zhì)性包括瘤間異質(zhì)性和瘤內(nèi)異質(zhì)性。前者反映出每個(gè)腫瘤都有一個(gè)屬于自己的突變通路；而瘤內(nèi)異質(zhì)性反映的是多克隆的存在，并非瘤內(nèi)所有細(xì)胞都發(fā)生了相同的突變。異質(zhì)性的存在反映了腫瘤研究的復(fù)雜性及個(gè)體化腫瘤治療的必要性。瘤內(nèi)異質(zhì)性的形成有幾種假說(shuō)模型：1）細(xì)胞起源模型，即突變起源于不同細(xì)胞，因而具有異質(zhì)性。2）遺傳模型，即同一細(xì)胞起源，不同初始事件促成腫瘤發(fā)生，因而形成異質(zhì)性。3）混合模型，即不同細(xì)胞起源和不同初始事件引起腫瘤發(fā)生［19］。

Nik-Zainal等［16］應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)繪制了21例乳腺癌患者的亞克隆結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了重要的信息。首先，在所有研究病例中，既發(fā)現(xiàn)了克隆突變，也發(fā)現(xiàn)了亞克隆突變，即突變?cè)谌炕蛞徊糠帜[瘤細(xì)胞中出現(xiàn)。有趣的是，克隆突變?cè)诎┌Y發(fā)生的早期出現(xiàn)，包含多種癌癥基因的突變，如PIK3CA、p53、Her-2、MYC及CCDN1擴(kuò)增以及遺傳性乳腺癌BRCA1和BRCA2野生型等位基因的缺失。奇怪的是，盡管很多癌癥基因的突變都是克隆突變，仍然有大量的亞克隆突變存在。事實(shí)上，對(duì)于多數(shù)病例，觀察到的亞克隆突變數(shù)量多于克隆突變數(shù)量。其次，在所有腫瘤中均有一個(gè)優(yōu)勢(shì)克隆占腫瘤細(xì)胞的50%～95%。該作者推測(cè)優(yōu)勢(shì)克隆的擴(kuò)張引發(fā)了腫瘤的診斷。最后，該研究發(fā)現(xiàn)了區(qū)分早發(fā)和遲發(fā)突變的不同突變簽名。早發(fā)突變C＞T比例高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與遺傳性乳腺癌相關(guān)的突變簽名。然而，Shah等［8］檢測(cè)了三陰乳腺癌患者的克隆異質(zhì)性，并證實(shí)在克隆頻率方面腫瘤變異存在的差異。一些腫瘤中有較少的亞克隆，而另外其他腫瘤中卻有10個(gè)以上的亞克隆，與上述的觀察結(jié)果不同。盡管p53，PIK3CA和PTEN等癌癥基因突變?cè)诙鄶?shù)樣本中均構(gòu)成最大克隆，但這些突變均不是發(fā)生在所有腫瘤細(xì)胞的完全克隆?？傊?，這些研究顯示了乳腺癌持續(xù)的遺傳進(jìn)化和克隆擴(kuò)增的動(dòng)態(tài)。瘤內(nèi)異質(zhì)性在抗癌治療和耐藥以及轉(zhuǎn)移進(jìn)展方面的研究正在進(jìn)行中，在不遠(yuǎn)的將來(lái)將會(huì)獲得具有生物學(xué)和臨床雙重意義的信息。

4 個(gè)體化醫(yī)學(xué)

乳腺癌個(gè)體化治療有賴(lài)于更科學(xué)實(shí)用的分型，進(jìn)而針對(duì)分型開(kāi)展有效的臨床工作。乳腺癌的分型經(jīng)歷了不同的階段，最初是依據(jù)形態(tài)學(xué)的病理分型，70%為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，因同種類(lèi)型的治療效果和預(yù)后差異較大［20］，這種分型對(duì)臨床指導(dǎo)意義不大。此后發(fā)展為表達(dá)分型，即以ER、PR和Her-2受體的表達(dá)水平為依據(jù)分為管狀A(yù)/B型（Luminal A/B）、基底樣癌（basal-like）、正常樣癌（normal-like）和Her-2過(guò)表達(dá)等類(lèi)型［21］，這種分型有效地指導(dǎo)了臨床治療實(shí)踐。在基因組學(xué)時(shí)代，技術(shù)的發(fā)展將會(huì)帶來(lái)更為精細(xì)化的乳腺癌分子分型，即基于基因組學(xué)信息的乳腺癌分子分型，這將有力的推動(dòng)乳腺癌的研究，極大加深對(duì)乳腺癌的認(rèn)識(shí)，更有效的指導(dǎo)乳腺癌的臨床實(shí)踐。

二代測(cè)序技術(shù)在乳腺癌個(gè)體化醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用已初現(xiàn)端倪。2011年美國(guó)癌癥研究會(huì)（AACR）年會(huì)首次報(bào)道了二代測(cè)序技術(shù)在乳腺癌臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用。研究者對(duì)來(lái)自2項(xiàng)臨床試驗(yàn)的50例ER陽(yáng)性乳腺癌患者進(jìn)行全基因組測(cè)序，其中26例患者對(duì)芳香酶抑制劑敏感、24例耐藥。并發(fā)現(xiàn)芳香酶抑制劑耐藥患者的突變數(shù)量顯著高于敏感患者。突變負(fù)荷可能是判斷治療效果的重要指標(biāo)［22］。此外另有研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)MAK3P1突變的ER陽(yáng)性乳腺癌患者芳香酶抑制劑可能是一種有效的治療方法，而TP53突變患者則通常對(duì)芳香酶抑制劑耐藥，應(yīng)該選擇其他治療方式［9］。在另外一項(xiàng)研究中，對(duì)三陰乳腺癌轉(zhuǎn)移患者開(kāi)展二代測(cè)序，發(fā)現(xiàn)全部14例患者中均存在激活MAPK通路和PI3K/AKT通路的突變。基于這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，研究者建立了一項(xiàng)新的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，對(duì)患者開(kāi)展MEK聯(lián)合AKT抑制劑治療［23］。盡管這些研究只是二代測(cè)序在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用的開(kāi)端，但成功的經(jīng)驗(yàn)將對(duì)后續(xù)大規(guī)模臨床研究具有指導(dǎo)意義。二代測(cè)序臨床應(yīng)用的真正意義在于能夠通過(guò)測(cè)序獲得患者基因組和轉(zhuǎn)錄組信息，選擇適合于患者的治療手段。隨著二代測(cè)序速度逐漸加快，成本逐漸降低，大規(guī)模臨床應(yīng)用正在逐漸成為現(xiàn)實(shí)［22］。

5 結(jié)語(yǔ)

近期開(kāi)展的二代測(cè)序研究較為全面系統(tǒng)地檢測(cè)了乳腺癌基因組，推進(jìn)了對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)了新的突變基因和通路，總結(jié)了突變簽名和克隆進(jìn)化，并對(duì)乳腺癌個(gè)體化醫(yī)學(xué)進(jìn)行了初步的探索。二代測(cè)序開(kāi)啟了乳腺癌基因組學(xué)研究的新篇章，未來(lái)的研究可以著力增大研究樣本，開(kāi)展多中心聯(lián)合研究，開(kāi)展比較基因組學(xué)研究，如不同腫瘤類(lèi)型間的比較，原發(fā)癌與轉(zhuǎn)移癌的比較等。進(jìn)行組學(xué)分析與功能實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，如在模式生物中研究特定環(huán)境暴露引發(fā)突變譜等，開(kāi)發(fā)更強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，以應(yīng)對(duì)海量測(cè)序數(shù)據(jù)，挖掘更有價(jià)值的信息。

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