中藥治療肝癌在機制方面的實驗研究概況

張慧慧，蘇金仁，黃秀深，陳繼蘭

·綜述進展·

中藥治療肝癌在機制方面的實驗研究概況

張慧慧，蘇金仁，黃秀深，陳繼蘭

目前對中醫(yī)藥治療肝癌的實驗研究很多，機制上大體從六個方面進行切入：誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或分化，抑制癌細(xì)胞增殖，抑制腫瘤血管生成，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性，抑制端粒酶活性，調(diào)節(jié)機體免疫功能。本文就著眼這六方面，從理論和方法學(xué)的角度加以綜述。

肝癌；凋亡；腫瘤血管；端粒酶；免疫

原發(fā)性肝癌（primary hepatic cancer, HCC），簡稱“肝癌”，是指原發(fā)于肝臟或肝內(nèi)膽管系統(tǒng)的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，我國每年肝癌的發(fā)生占全世界肝癌發(fā)生的45%，其死亡率在城市和農(nóng)村分別是癌癥死亡率的第2位和第1位[1]。目前，通過外科手術(shù)切除治療肝癌是最主要的方法之一，然肝癌起病隱匿，發(fā)展快，一旦發(fā)現(xiàn)多為中晚期，失去了手術(shù)機會，轉(zhuǎn)移性肝癌則無法進行手術(shù)。有調(diào)查研究顯示，若不能早期發(fā)現(xiàn)并進行有效治療，肝癌患者的總體5年生存率不超過5%[2]。中藥作為綜合治療的一種，具有抑制腫瘤生長、改善癥狀體征、提高生存質(zhì)量、延長生存期等優(yōu)勢，正發(fā)揮著越來越重要的作用。中藥實驗研究治療肝癌的機制主要從以下幾個方面進行：誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或分化、抑制癌細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性、調(diào)節(jié)機體免疫功能[3]。現(xiàn)將近幾年中藥治療肝癌的機理實驗研究綜述如下。

1 誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡或分化

細(xì)胞凋亡的概念是1972年Kerr等人根據(jù)正常組織中存在著散在不完整細(xì)胞及細(xì)胞碎片的形態(tài)學(xué)特征首次提出的[4]。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是在一定的生理和病理條件下，由基因調(diào)控，遵循自身程序的細(xì)胞自主性死亡。Tessitone等在大鼠肝癌細(xì)胞的組織切片上觀察到凋亡的特征性改變：染色質(zhì)濃聚和凋亡小體，核酸電泳亦出現(xiàn)了DNA階梯條帶。細(xì)胞凋亡一方面受細(xì)胞內(nèi)在調(diào)節(jié)機制的控制，即原癌基因的激活和抑癌基因的失活，擾亂了細(xì)胞正常的增殖和分化，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，分化不足。此相關(guān)基因有P53，bcl-2,C-myc,Rb等等。另一方面受細(xì)胞外界刺激因子的影響，可被一系列的受體激活而促發(fā)，主要有Fas,TGF-β和TNF-α受體。中藥在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的研究，既有單味中藥的有效成分，也有中藥復(fù)方的研究，一般從四方面進行研究：凋亡細(xì)胞的形態(tài)（細(xì)胞濃縮，體積縮小，包膜突起，細(xì)胞漿中細(xì)胞器密集及DNA斷裂成凋亡小體）；凋亡生化特征（DNA梯形電泳）；對細(xì)胞周期的影響；肝癌凋亡基因調(diào)控[5]。目前通常采用檢測方法有[6]:①形態(tài)觀察法。通過應(yīng)用各種染色法并借助倒置顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡等可觀察；②DNA瓊脂糖凝膠電泳法。此法經(jīng)典之處在于DNA斷裂成“梯狀”條帶便是凋亡特征性指標(biāo)；③MMT法。檢測癌細(xì)胞生長抑制率；④流式細(xì)胞儀法。檢測細(xì)胞周期；⑤AnnexinV-PI雙標(biāo)法。可區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死；⑥Hoechest熒光染色法可計數(shù)凋亡百分比；⑦TUNEL法（DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法）。用熒光原位標(biāo)記后可觀察凋亡細(xì)胞。檢測指標(biāo)方面并沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大抵有： Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Fas、MMp。

誘導(dǎo)分化是指惡性腫瘤在誘導(dǎo)分化劑的存在下，重新分化向正常成熟方向逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，ALB是肝細(xì)胞分化成熟的指標(biāo)，AFP反應(yīng)細(xì)胞惡性程度。相關(guān)實驗顯示，誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化均會出現(xiàn)ALB分泌量增多，而AFP減少。

2 抑制癌細(xì)胞增殖

正常細(xì)胞癌變的主要特征是細(xì)胞異常增殖，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)，是反映細(xì)胞增殖活性的良好指標(biāo)[7]。就目前已報道的實驗顯示，①通過抑制癌細(xì)胞PCNA的表達可以抑制癌細(xì)胞增殖[8]。②抑制細(xì)胞分泌甲胎蛋白（AFP），降低細(xì)胞γ谷氨酰轉(zhuǎn)酞酶（γ-GT）活性，升高堿性磷酸酶（ALP）活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[9]。③抑制癌細(xì)胞DNA、RNA合成，使細(xì)胞周期失控。有研究顯示川芎嗪和苦參素抑瘤作用主要表現(xiàn)在抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖。

3 抑制腫瘤血管生成

1972年Folkman首次提出“腫瘤生長依賴血管生成”的概念，即是在腫瘤內(nèi)部原有微血管“芽生”新生毛細(xì)血管。惡性腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移必須依靠新生血管提供足夠的營養(yǎng)才能實現(xiàn)。惡性腫瘤的新生血管形成過程大致可以分為以下六方面[10]：①腫瘤細(xì)胞及其它相關(guān)細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種血管生成因子。②在血管生成因子的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，包括細(xì)胞器數(shù)目的增多、大小的改變以及偽足的形成。③內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放多種蛋白溶酶以降解細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管基底膜，繼而引起細(xì)胞外基質(zhì)重塑。④內(nèi)皮細(xì)胞從毛細(xì)血管后微靜脈遷出來，形成血管新芽；⑤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖；⑥腫瘤血管結(jié)構(gòu)重建。腫瘤血管生成的特點：①不成熟性和失控性[11]，且微血管較豐富。在無血管期，瘤細(xì)胞生長主要通過宿主的血管床來吸取養(yǎng)料，此時瘤生長速度緩慢，體積小。②進入血管期，瘤細(xì)胞釋放多種血管生成因子，促使血管生成，瘤體得到大量養(yǎng)料供應(yīng)，增生快速，體積增大。③腫瘤血管具有不完整的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，基底膜較稀疏，腫瘤血管是被動血管，既沒有平滑肌也沒有神經(jīng)末梢，血流依賴于體循環(huán)[12]。

抑制血管生成便成近年腫瘤治療研究的熱點，主要集中在三方面[3]：①抑制基質(zhì)金屬蛋白酶；②阻斷血管內(nèi)皮生長因子（VEGP）途徑；③抑制avb3-integrin的功能。

其中，VEGP是主要的促血管生長因子，是腫瘤血管形成的關(guān)鍵因素，是肝癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[13]。阻斷途徑有四[14]：抑制腫瘤細(xì)胞分泌腫瘤血管形成促進因子和促進分泌腫瘤血管形成抑制因子；抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂；使腫瘤血管形成因子的活性封閉；組織宿主血管長入。促血管生長因子還有：TGF、bFGF、EGF、MMPs。

4 抑制端粒酶活性

端粒酶是一種核糖蛋白多聚糖，是合成端粒必需的酶，正常體細(xì)胞組織端粒酶為陰性，腫瘤細(xì)胞均具有端粒酶活性，端粒酶的激活是腫瘤細(xì)胞無限增殖的必要條件[15]。端粒酶在癌細(xì)胞中表達率達8%-9%。因而端粒酶已被認(rèn)為是癌癥治療的新靶標(biāo)，以端粒酶為靶點的腫瘤抑制策略，即通過抑制端粒酶活性或基因表達使腫瘤細(xì)胞不能有效合成端粒系列從而發(fā)生凋亡，達到治愈腫瘤的目的[16]。有研究顯示，EGCG能抑制肝癌細(xì)胞端粒酶活性，且隨著濃度的增加和時間延長，端粒酶活性逐漸下調(diào)，并能抑制肝癌細(xì)胞hTRET、mRNA的表達。

5 逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性

腫瘤多藥耐藥性指腫瘤細(xì)胞對某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對其他結(jié)構(gòu)無關(guān)、作用機制各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥（MDR），是腫瘤化療失敗的主要原因之一，所以尋找有逆轉(zhuǎn)MDR作用而不良反應(yīng)小的化療增敏劑有重要意義。MDA的過度表達不僅與肝癌的內(nèi)在性耐藥相關(guān)，而且與其生物學(xué)惡性表型、預(yù)后相關(guān)。

6 調(diào)節(jié)機體免疫功能

腫瘤患者的免疫功能不僅與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，而且對判斷腫瘤患者治療效果和評估疾病預(yù)后有重要的參考價值[17]。細(xì)胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要機制，T淋巴細(xì)胞在機體抗腫瘤的免疫應(yīng)答過程中處于關(guān)鍵地位。對肝癌患者進行T細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞活性的測定，可基本反映機體的細(xì)胞免疫功能，對于判斷預(yù)后有重要參考價值。甲胎蛋白是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中表達的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是標(biāo)志性蛋白而用于肝癌的早期診斷[18]。提高機體免疫功能，激發(fā)其抗腫瘤免疫效應(yīng)，組織腫瘤的生長、播散和復(fù)發(fā)，是中藥復(fù)方抗腫瘤作用的又一重要機制。有的中藥能夠激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞，并能促進機體多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如干擾素、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-1、IL-2、IL-6等來增強機體的免疫功能，激活補體系統(tǒng)，對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的整體調(diào)節(jié)作用[19]。然就目前研究來看，復(fù)方相對單味中藥的研究而言較少，也正是我們接下來需要深入研究的方向。

上述六方面是目前實驗研究肝癌治療的基本方向，相對于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“殺敵一千，自損八百”的創(chuàng)傷性治療手段，中醫(yī)藥治療肝癌最顯著特點在于：療效確切；無明顯毒物作用；適用于帶瘤生存的全過程，而無其他療法的局限性[20]。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

Experimental study of the mechanisms of the traditional Chinese medicine in the treatment of liver cance

ZHANG Hui-hui, SU Jin-ren, HUANG Xiu-shen, CHEN Ji-lan //(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China)

At present, many experimental studies on traditional Chinese medicine treatment of liver cancer have been carried out. The mechanisms mainly include six aspects: induction of tumor cell apoptosis or differentiation; inhibition of cancer cell proliferation; inhibition of tumor angiogenesis; reversal of tumor multidrug resistance; inhibition of telomerase activity; regulation of body immune function. The paper reviews the mechanisms in the theory and methodology from the six aspects.

Liver cancer；apoptosis；tumor vessel；telomerase；immune

R 285

A

1674-926X(2014)04-019-03

成都中醫(yī)藥大學(xué) ，四川 成都 611137

張慧慧 ，女(1989-)，寧夏吳忠人，在讀碩士研究生，主要從事中藥品種、品質(zhì)與資源開發(fā)研究以及疾病動物模型研究 Tel:15928539990

黃秀深，男( 1955- )，重慶人，教授，主要從事脾胃疾病相關(guān)復(fù)方研究 Email:jcbl7747@sina.com.cn

2013-07-15