人喉癌細(xì)胞系的建系研究進(jìn)展△

湯瑋晶 陶磊

·綜 述·

人喉癌細(xì)胞系的建系研究進(jìn)展△

湯瑋晶 陶磊

細(xì)胞系的建立可以詳細(xì)分析腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、抗原性和細(xì)胞原性的特征。喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，病理分型以鱗狀細(xì)胞癌為主。本文就細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞系和細(xì)胞株的建立和保存，腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、人喉癌細(xì)胞系的建系情況、建系方法、細(xì)胞系的主要特性和細(xì)胞系培養(yǎng)過程中存在的問題進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞系建立的研究背景

美國動(dòng)物學(xué)家Ross Granville Harrison于1907年首次成功地在體外培養(yǎng)基(凝結(jié)的淋巴液)中培養(yǎng)了神經(jīng)元，被稱為“組織培養(yǎng)之父”。進(jìn)入20世紀(jì)50年代后，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到快速發(fā)展。如今，細(xì)胞培養(yǎng)已成為全世界有關(guān)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)廣為應(yīng)用的技術(shù)之一[3]。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞株[4]將從有機(jī)體得到的細(xì)胞在體外進(jìn)行第1次培養(yǎng)，稱之為原代培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。如果對(duì)原代培養(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此時(shí)的培養(yǎng)物就稱為細(xì)胞系。通過選擇或克隆化培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群稱為細(xì)胞株。在實(shí)際運(yùn)用中，細(xì)胞系和細(xì)胞株的概念常常被相互混淆。

1.3 細(xì)胞系(株)的保存[5]已經(jīng)建立的細(xì)胞系(株)由作者自行管理不便于使用交流，同時(shí)還存在細(xì)胞易污染和丟失等弊病。建立細(xì)胞庫(cell bank)，使已經(jīng)建立的細(xì)胞系(株)能得到妥善保存，并方便各實(shí)驗(yàn)室交流使用。從20世紀(jì)60年代起，發(fā)達(dá)國家都先后建立細(xì)胞庫保存各類細(xì)胞系(株)，其中美國典型培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection, ATCC)是現(xiàn)今世界最大的細(xì)胞庫。

1.4 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng) 由于細(xì)胞培養(yǎng)是研究細(xì)胞分裂增殖活動(dòng)的很好手段，因而也成為研究腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性、腫瘤發(fā)生及發(fā)展病理和腫瘤藥物篩選等的重要技術(shù)[6]。體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞是研究細(xì)胞生物學(xué)特性、癌變機(jī)制和癌癥治療的良好生物學(xué)模型。由于從新鮮腫瘤組織中難以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，因此建立細(xì)胞系可以提供大量細(xì)胞以滿足實(shí)驗(yàn)要求。細(xì)胞系的建立可以詳細(xì)分析腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、抗原性和細(xì)胞原性的特征[7]。

癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)一樣具有無限生長和分化不全的特點(diǎn)，因此比正常細(xì)胞容易培養(yǎng)和建系。但由于培養(yǎng)技術(shù)上的限制，對(duì)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)經(jīng)歷了漫長的困難時(shí)期。從20世紀(jì)50年代開始，抗生素、合成培養(yǎng)基和玻璃器皿等培養(yǎng)用品以及胰蛋白酶消化處理技術(shù)陸續(xù)被引進(jìn)到體外培養(yǎng)領(lǐng)域，使得對(duì)人類惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)進(jìn)入了一個(gè)飛速發(fā)展時(shí)期。1952年，Scherer等[8]首先成功地建立了來源于宮頸癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞系，標(biāo)志著世界上第一個(gè)細(xì)胞系的誕生。后來，人癌細(xì)胞系如口腔癌、喉癌和肺癌等細(xì)胞系相繼被建立起來。

1.5 人喉癌細(xì)胞系的建系情況 喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，我國喉癌的發(fā)生率有逐年上升的趨勢，2003～2007年中國喉癌粗發(fā)病率為2.04/10萬[9]。喉癌的病理分型以鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)為主[10]。

早在20世紀(jì)50年代，國外就有了一些有關(guān)喉癌及其他頭頸癌細(xì)胞系建系的報(bào)道。1955年Morre等[11]建立了來源于喉鱗癌的Hep-2細(xì)胞系及其他3個(gè)鱗癌細(xì)胞系。1978年，Krause等[12]從194例頭頸部鱗癌患者的標(biāo)本中建立了3個(gè)細(xì)胞系。到20世紀(jì)80年代后，有關(guān)頭頸部鱗癌細(xì)胞系建立的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多。1981年Easty等[13]對(duì)36個(gè)臨床患者手術(shù)切除的腫瘤組織進(jìn)行分離培養(yǎng)，建立了10個(gè)人鱗癌細(xì)胞系，分別來自于舌部和喉部，命名為HN-1至HN-10，其中NH-2、4、8、10為來源于喉鱗癌。1988年Sacks等[14]建立了2例來源于未經(jīng)治療的頭頸部鱗癌患者的細(xì)胞系。1997年Kim等[15]建立了9個(gè)來源于頭頸部腫瘤的細(xì)胞系，其中AMC 1-8來源于鱗癌，AMC 9來源于腮腺的未分化癌。1999年，Ku等[16]建立了6個(gè)人喉鱗癌細(xì)胞系。2010年，Liebertz等[17]建立了一株新的頭頸部鱗癌細(xì)胞系，命名為USC-HN1。

正如問題描述的那樣，我們有10萬大小的訓(xùn)練集和10萬大小的測試集。在此基礎(chǔ)上，可以對(duì)有標(biāo)簽的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集采用各種算法(如 Logistic、Adaboost、Randomforst 等)，通過調(diào)整算法參數(shù)和過采樣策略，生成大量模型，分別對(duì)測試數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)測。

目前國內(nèi)用于喉癌研究的主要是Hep-2細(xì)胞系及裸鼠移植瘤細(xì)胞系，但有文獻(xiàn)報(bào)道Hep-2已被HeLa細(xì)胞污染[14]。我國在21世紀(jì)初開始有自行建立喉癌細(xì)胞系的報(bào)道，馬麗晶等[7]應(yīng)用體外培養(yǎng)技術(shù)對(duì)24例喉鱗癌組織進(jìn)行培養(yǎng)，1例獲得成功，建立了命名為LSC-1的細(xì)胞系。蔡萍等[18]為了便于體外深入研究無人乳頭瘤病毒(HPV)感染的喉癌發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及HPV與喉癌演進(jìn)的關(guān)系，通過裸鼠皮下移植瘤建立了1株HPV陰性的喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，命名為Lsc-02。任樂榮等[19]取喉癌患者原發(fā)病灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，建立了2個(gè)人喉癌細(xì)胞系，分別命名為CCC-HLS和CCC-HLSLN。

2 人喉癌細(xì)胞系的建系方法

2.1 細(xì)胞系的標(biāo)本來源 主要來源于臨床喉癌患者活檢或手術(shù)切除的標(biāo)本，亦有使用局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)作為細(xì)胞系的標(biāo)本來源。標(biāo)本病理為鱗癌。

2.2 細(xì)胞系的建系過程 常采用常規(guī)組織塊培養(yǎng)法或膠原酶消化法，成纖維細(xì)胞的清除采用酶消化法或反復(fù)貼壁法等[20]。

此外，亦有采用裸鼠皮下移植瘤的方法建立細(xì)胞系[21]。由于體外腫瘤細(xì)胞系建系較困難，裸鼠的過渡以及促細(xì)胞生長因子的運(yùn)用可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的活力，使得早期傳代細(xì)胞順利越過危險(xiǎn)期從而長期傳代[18]。

3 人喉癌細(xì)胞系的主要特性及鑒定

3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[10]在相差倒置顯微鏡下，活細(xì)胞為上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈梭形或多邊形，似鋪路石樣排列，可重疊生長。HE染色可見細(xì)胞具有高度的異型性，細(xì)胞形態(tài)及大小不一致；核呈多形性，大小、形態(tài)及染色不一致，部分胞核漿比例增大(接近1∶1)，核仁肥大，數(shù)目增多，核分裂象增多，出現(xiàn)不對(duì)稱、多極性等病理性核分裂，偶見巨核細(xì)胞。

掃描電鏡見細(xì)胞表面有大量的微絨毛及突起，新生細(xì)胞呈圓形。透射電鏡下可見細(xì)胞核明顯增大，核膜可有內(nèi)陷或外凸，核的形態(tài)不規(guī)則，核異染質(zhì)增多，凝集成塊狀或聚集在核膜下；核仁增大，數(shù)目增多，形態(tài)和位置不規(guī)則。胞質(zhì)中可見張力原纖維，顯示出鱗癌的特征。

角蛋白存在于正常復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞及大部分來源于復(fù)層鱗狀上皮的腫瘤細(xì)胞[22]，故細(xì)胞角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陽性可證實(shí)細(xì)胞來源于上皮細(xì)胞。

3.2 細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué) 通過測定繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞貼壁率以及軟瓊脂細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)等判斷細(xì)胞的生長情況。

3.3 細(xì)胞生物學(xué)性狀的鑒定核型分析 可見細(xì)胞染色體有缺失、斷裂、易位等結(jié)構(gòu)異常[23]。此外，亦有細(xì)胞周期分析，基因突變檢測等[16]。

3.4 裸鼠移植成瘤[7]細(xì)胞接種裸鼠后，處死裸鼠后取下腫瘤。大體形態(tài)觀察：腫瘤為多發(fā)或單發(fā)，實(shí)性，包膜完整，包膜表面有豐富的血管，切面白色，質(zhì)脆，中心有壞死液化；病理組織學(xué)證實(shí)為鱗癌，分化較差，其形態(tài)與原腫瘤相似。

3.5 細(xì)胞系污染情況鑒定[24]主要檢查是否有支原體污染，多數(shù)細(xì)胞受支原體污染后無明顯變化，仍能生長，故需及時(shí)鑒別處理。常用熒光染色法觀察，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。若細(xì)胞被支原體污染，早期可采用添加抗生素或使用支原體特異性血清去除。做好預(yù)防工作比污染后再用藥效果好。

3.6 其他[15-17]一些細(xì)胞系亦進(jìn)行了EB病毒(EBV)、HPV等的篩選，白細(xì)胞分化抗原(CD)、細(xì)胞因子(CK)等細(xì)胞表面分子標(biāo)記物的檢測以及Notch1蛋白水平的測定等。

4 人喉癌細(xì)胞系建系過程中存在的問題

許多已建立的細(xì)胞系尚未達(dá)到永生化，有關(guān)細(xì)胞系的藥物敏感實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞表面分子表達(dá)情況的研究尚未進(jìn)行，仍需進(jìn)一步深入研究[7]。此外，長期培養(yǎng)可使細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變；建系過程中可能受到各種污染，如微生物尤其是支原體的污染、來自同一患者的非惡性細(xì)胞污染以及細(xì)胞系間的交叉污染等[24]。

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(本文編輯 楊美琴)

國家自然基金青年基金(30801283)；上海市科委青年科技啟明星(09QA1401000)；上海市衛(wèi)生局優(yōu)青計(jì)劃(XYQ2011055)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031

陶磊(Email: doctortaolei@163.com)

2013-07-16)