抗草甘膦雜草檢測方法的研究進展

楊浩娜， 柏連陽，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，湖南長沙 410128； 2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南長沙 410125)

草甘膦是美國孟山都公司于20世紀70年代研制出的一種廣譜滅生性除草劑，可以防除一年生和多年生雜草。因為草甘膦理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性、高效低毒、低殘留等其他除草劑所不具備的優(yōu)點，現(xiàn)已成為世界最主要的除草劑之一。我國自1980年開始生產(chǎn)草甘膦以來，逐漸成為全球生產(chǎn)和銷售草甘膦的中心[1]，起初草甘膦在我國僅在果園使用，后來隨著少耕免耕等耕作方式的改變和作物行間的定向保護性噴霧技術(shù)的發(fā)展[2]，使得草甘膦使用范圍得到進一步擴大。草甘膦現(xiàn)在既廣泛用于橡膠、桑、茶、果園等田地，也用于大豆、棉花、水稻、小麥等草本科農(nóng)田。長期使用單一的除草劑必將加快雜草產(chǎn)生抗藥性。草甘膦具有獨特的作用方式和代謝機制，在土壤中殘留量極低，使人們認為在田間不可能有雜草對草甘膦產(chǎn)生抗藥性[3]。然而，1996年澳大利亞首次報道發(fā)現(xiàn)抗草甘膦瑞士黑麥草(Loliumrigidum)之后，越來越多的抗草甘膦雜草在世界范圍內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，給草甘膦的應(yīng)用帶來了前所未有的挑戰(zhàn)，引起了國內(nèi)外專家的極大關(guān)注[3]。在國內(nèi)，越來越多的雜草被發(fā)現(xiàn)對草甘膦產(chǎn)生抗藥性，如廣東省發(fā)現(xiàn)牛筋草對草甘膦產(chǎn)生抗性[4]，湖南省、浙江省發(fā)現(xiàn)小飛蓬對草甘膦產(chǎn)生抗性[5-6]等。因此，建立一套科學(xué)快速的抗草甘膦雜草檢測方法，為雜草抗藥性和農(nóng)田施藥指導(dǎo)等相關(guān)工作提供理論支撐意義深遠。本研究總結(jié)歸納科學(xué)有效的抗草甘膦雜草檢測方法，旨在為農(nóng)田抗草甘膦雜草檢測體系的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 常用檢測方法

1.1 培養(yǎng)皿法

培養(yǎng)皿檢測法以其簡單、快速、方便等特點[7]，一直被人們用于各類雜草抗藥性檢測試驗當(dāng)中。Perez等和 Lenardo等利用培養(yǎng)皿法成功檢測了智利果園多花黑麥草(Loliummultiflorum)和巴西的馬唐(Digitariainsularis)對草甘膦的抗藥性水平[8-9]。培養(yǎng)皿檢測法首先需要將待測雜草種子打破休眠，然后配制等量不同濃度的草甘膦藥液，其濃度梯度設(shè)置為6～8個，一般設(shè)置為6個，其中1個為空白對照，待藥液均勻浸濕濾紙后，再將剛露白的種子放在培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置待測雜草最適的溫度、濕度和光照條件。處理1～3周后，通過測定待測雜草種子的發(fā)芽數(shù)、主根長、芽長等指標，對其抗藥性水平進行檢測。不同種群的雜草，其參照指標并不相同。

1.2 整株檢測法

整株檢測法相對于培養(yǎng)皿檢測法來說，其周期時間長，占用空間大，但因其具有簡單易行、重復(fù)性好等優(yōu)勢，被認為是檢測雜草抗藥性最普遍有效的方法[10]，也被國際雜草抗藥性管理組織推薦為主要檢測方法[11]。楊彩宏等利用整株檢測法成果地檢測出廣東省牛筋草(Eleusineindica)對草甘膦的抗性水平[4]。整株檢測法一般采用Ryary法，將待測雜草的種子打破休眠后，統(tǒng)一進行盆栽，放置在溫室或者培養(yǎng)箱中，設(shè)置待測雜草最適的溫度、濕度和光照條件，雜草生長期間定時澆水，定期拔出非目標雜草。1～2個月后，待雜草長到5 cm以上，一般為3～6葉期為宜，不同雜草應(yīng)根據(jù)本身條件而定。禾本科雜草一般為3～4葉期，闊葉雜草等須根據(jù)其生長情況而定，一般以其生物量適合稱量為宜。處理前對待測雜草進行間苗，選擇長勢一致的為同一批次，用6～8個不同劑量的草甘膦溶液處理待測雜草，一般設(shè)置為6個，其中1個為空白對照，噴霧處理24 h內(nèi)最好不要對施藥雜草澆水。1～4周后，稱取雜草地上部分，測量其鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等指標。不同雜草應(yīng)根據(jù)本身條件而定，不同劑量處理之后，待測雜草產(chǎn)生不同程度藥害表現(xiàn)情況即可。并根據(jù)施藥劑量和相應(yīng)指標變化量得出線性回歸方程，計算出引起50%死亡的劑量RD50。

1.3 癥狀指數(shù)法

草甘膦處理雜草后，雜草會對應(yīng)出現(xiàn)葉片變黃、萎蔫等藥害癥狀，一般其嚴重程度和施藥劑量呈正相關(guān)。陳景超等根據(jù)雜草癥狀嚴重程度將其分為6個級別[12]。該方法前處理和整株檢測法一樣，待雜草噴藥后，1～4周左右出現(xiàn)藥害癥狀，可根據(jù)雜草的藥害表現(xiàn)，對應(yīng)相應(yīng)級別，記錄每個處理中每株雜草的級別，統(tǒng)計不同濃度處理雜草的總癥狀級別指數(shù)，得出線性回歸方程。癥狀指數(shù)法操作簡單，重復(fù)性好，可以同時和整株法聯(lián)用；但是由于各個癥狀級別之間的界限不明顯，植株癥狀表現(xiàn)形式劃分也帶有一定的主觀性，所以具有一定的局限性，一般不將其作為主要的檢測方法。

1.4 莽草酸含量法

草甘膦的作用機理主要是通過競爭性抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性，造成莽草酸堆積，合成過程受阻[13]，使植株不能正常生長。抗性水平不一致的雜草被草甘膦處理過后，其植株體內(nèi)莽草酸含量變化的情況也不一樣，敏感種群植株會迅速積累大量莽草酸，明顯多于抗性種群[14]。因此，通過檢測比較雜草莽草酸含量變化，可以得出雜草是否產(chǎn)生抗藥性。Vangessle 和Feng等 通過測定莽草酸含量，得出小飛蓬(Conyzacanadensis)對草甘膦的抗藥性，其結(jié)果與整株法和培養(yǎng)皿法結(jié)果相同[15-16]。楊彩宏在檢測牛筋草(Eleusineindica)對草甘膦的抗性水平的試驗中，也使用了莽草酸含量法，其結(jié)果也得到驗證[4]。莽草酸含量法操作簡單，不用大量重復(fù)試驗。用草甘膦藥液處理長勢一致的3～6葉期待測植株，以12 h為倍數(shù)設(shè)定樣品采集間隔，采集待測植株頂端葉片組織，用液相色譜儀或者紫外分光光度計測量雜草體內(nèi)莽草酸含量，依據(jù)雜草體內(nèi)莽草酸隨時間變化的趨勢可以得出雜草抗性情況。設(shè)置不同濃度的草甘膦藥液處理待測雜草，檢測莽草酸含量，也可以得出待測植株對草甘膦的抗性水平[17]。

2 其他檢測方法

2.1 EPSPS檢測法

EPSPS是草甘膦作用靶標酶，通過測定草甘膦處理后植株靶標酶活力的變化，檢測待測植株是否產(chǎn)生草甘膦抗藥性。Baerson等通過對剛性黑麥草(Loliumrigidum)EPSPS活力測定，檢測出不同剛性黑麥草對草甘膦產(chǎn)生不同抗性水平[18]。EPSPS檢測法類似于莽草酸含量法，但是其操作復(fù)雜，需要靈敏度高的儀器，成本也較高。而且并不是所有的抗草甘膦雜草在草甘膦處理后，其EPSPS活性都會增加，因此，不能成為抗草甘膦雜草的常用檢測方法，只適用于部分抗草甘膦雜草的檢測。

2.2 葉綠素含量法和葉綠素?zé)晒鈪?shù)法

草甘膦由植株莖葉的吸收，通過紊亂植株體內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程，導(dǎo)致植株死亡，其雖然不屬于光合作用抑制劑類農(nóng)藥，但阮祚禧等[19]和卜貴軍等[20]認為，草甘膦會對藍藻葛仙米(N.sphaeroides)和大豆的光合作用和葉綠素?zé)晒鈪?shù)產(chǎn)生影響，因此，通過測定葉綠素含量變化和葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠在一定程度上檢測抗草甘膦雜草的抗藥性水平。葉綠素含量法和葉綠素?zé)晒鈪?shù)法用不同濃度草甘膦處理長勢一致的3～6葉期待測植株，處理1～2周后，隨機采取植株頂端第2層完全展開的葉片為測量對象，以24 h為倍數(shù)設(shè)定樣品采集間隔，規(guī)定采集時間段，采集樣品。葉綠素含量測定可選用丙酮和乙醇的混合液浸提法[21]，或者HPLC等方法[22]，得出施藥后不同抗性水平植株葉綠素a、葉綠素b的含量變化。管銘等[23]和楊彩宏等[4]都曾經(jīng)利用葉綠素?zé)晒鈪?shù)法檢測假稻種群[Leersiajaponica(Makino) Honda]和牛筋草(Eleusineindica)的敏感性和抗藥性。

2.3 DNA分析法

目前，大部分雜草對草甘膦抗藥性的機理研究都圍繞雜草DNA、RNA分子方面展開。根據(jù)植物基因的改變情況和程度，也可為其抗藥性水平推斷提供依據(jù)。通過采集待測植株的樣品，提取出總DNA，參考文獻資料或者基因庫設(shè)計合成引物，PCR擴增之后，獲取EPSPS基因目的片段進行測序。通過同種雜草的同源性比對分析，可以檢測雜草抗藥性。2004年Ng等通過提取不同地區(qū)牛筋草(Eleusineindica)的DNA，測序比對EPSPS基因片段，得出抗性種群基因突變的結(jié)果[24]。2010年Gaines等通過提取長芒莧(Amaranthuspalmeri)的RNA，進行同源性分析，也得出抗性和敏感種群之間的差異[25]。此類方法具有取樣簡單、檢測速度快、準確性高等優(yōu)點，而且還可以同時為分析抗性產(chǎn)生的原因提供依據(jù)；但其重復(fù)性不高，每株雜草的突變點都不同，很難得出準確的抗性水平，所以較少用來作為雜草抗性的檢測方法。

2.4 RT-PCR分析法

實時熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù)1996年在美國推出之后，迅速在生物學(xué)各研究領(lǐng)域得到廣泛運用，已經(jīng)成為一項不可或缺的重要技術(shù)。與常規(guī)PCR相比，RT-PCR具有更強的特異性，并且能對模板進行定量分析。通過采集草甘膦處理后的待測植株，提取RNA，將其RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后，參考文獻資料或者基因庫設(shè)計合成引物，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，PCR擴增之后，獲取帶有熒光基團的EPSPS基因目的片段，根據(jù)Ct值可以得出起始模板拷貝數(shù)[26]，反映出草甘膦處理后雜草EPSPS的表達量差異，因此根據(jù)待測雜草EPSPS表達量的差異，可以檢測雜草抗藥性。Gaines等通過提取長芒莧(Amaranthuspalmeri)的RNA，進行RT-PCR分析，得出抗性和敏感種群之間EPSPS表達量的差異[25]。

3 結(jié)論

隨著草甘膦使用范圍的擴大和使用量、使用年限的增加，抗草甘膦雜草種類數(shù)目快速增長[27-28]。除了本研究提及的檢測方法，雜草抗藥性檢測還有其他方法，如分蘗檢測法、花粉粒檢測法等，由于這類方法實際操作中存在不足之處，所以沒有用于雜草對草甘膦抗藥性的檢測。目前雜草對草甘膦抗藥性檢測中，運用最廣泛的是整株檢測法，該法簡單易行，可以同時進行大量樣本檢測，而且結(jié)果準確性較高，但所需時間較長。而莽草酸含量法以及葉綠素含量法、葉綠素?zé)晒鈪?shù)法前期雜草處理跟整株檢測法是相同的，因此，可以將這幾種方法結(jié)合起來同時使用，提高檢測結(jié)果的準確性，完善雜草對草甘膦抗藥性的檢測體系。雜草DNA、RT-PCR分析檢測法取樣簡單，準確性高，雖尚處于起步階段，但值得進行深入研究。

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