容積敏感性外向整流氯離子通道的調(diào)節(jié)機(jī)制及藥理學(xué)探討＊

楊 磊，王曉明

(中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032)

作為哺乳動(dòng)物基本單位的細(xì)胞，其內(nèi)外存在各種離子(Na+，K+，Cl－)，其環(huán)境變化是導(dǎo)致疾病的基礎(chǔ)。除陽(yáng)離子外，陰離子也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Cl－是體內(nèi)最豐富的陰離子，它進(jìn)出細(xì)胞的過(guò)程，除 Cl－－HCO3－交換及 Na+－Cl－，Na+－K+－2Cl－和 K+－Cl－聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)外，經(jīng)過(guò)陰離子通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)是重要方式之一，由于在生理?xiàng)l件下陰離子通道介導(dǎo)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)主要為Cl－，所以通常稱為氯離子通道。氯離子通道廣泛存在于各種細(xì)胞上，但因其電導(dǎo)較小、研究難度較大以及缺乏特異性抑制劑等因素，使其相關(guān)研究存在很多問(wèn)題。隨分子生物學(xué)和電生理方法的結(jié)合，氯離子通道的研究進(jìn)入了快速發(fā)展時(shí)期。同時(shí)，隨著新藥創(chuàng)新的研發(fā)，與其相關(guān)的中藥單體研究也成為焦點(diǎn)。心臟Cl－通道研究發(fā)現(xiàn)了6種不同的 Cl－電流[1－2]，目前認(rèn)為存在4種 Cl－通道，即 CFTR 基因編碼的Cl－通道，ClC－3編碼的，ClCA1編碼的，ClC－2編碼的。其中與ClC－3密切相關(guān)的容積敏感性外向整流氯離子通道(VSOR)在維護(hù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用[3]，并與細(xì)胞的退行性改變及存亡密切相關(guān)。

1 生理學(xué)特性及生物電活動(dòng)

VSOR電流廣泛表達(dá)于幾乎所有脊椎動(dòng)物的細(xì)胞中，在維持細(xì)胞正常容積的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[4]。在細(xì)胞的體積增大及調(diào)節(jié)性容積減小(RVD)過(guò)程中，VSOR發(fā)揮核心作用，RVD的完成主要通過(guò)氯通道和鉀通道使Cl－和K+外流，而完成細(xì)胞容積減小的過(guò)程。目前認(rèn)為，在心肌細(xì)胞，容積調(diào)控氯電流不僅對(duì)生理狀態(tài)下細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)起重要作用，而且與心肌細(xì)胞的多種病理生理過(guò)程有關(guān)。

在哺乳動(dòng)物，細(xì)胞腫脹后都能激活典型的陰離子電流，在生理?xiàng)l件下，該電流主要為Cl－，所以通常稱為容積調(diào)控氯電流。該電流典型的生物物理學(xué)特點(diǎn)為[5]:1)通道的離子選擇性通透順序?yàn)?SCN－＞I－＞NO3－＞Br－＞Cl－＞F－＞gluconate－[6]，對(duì)較大的陰離子如天冬氨酸、谷氨酸、氨基乙磺酸均有通透性;2)該電流的激活是非電壓依賴性的，但在電壓超過(guò)+60 mV時(shí)，出現(xiàn)緩慢失活，在負(fù)電壓時(shí)，該電流快速?gòu)?fù)活;3)雖然胞外Cl－濃度高于胞內(nèi)，但由于平衡電位的存在，該電流表現(xiàn)為輕度的外向整流特性，去極化時(shí)無(wú)明顯的時(shí)間依賴性。在一些細(xì)胞，可能由于通道蛋白有所不同，Icl，vol沒(méi)有明顯的整流和失活過(guò)程;4)在牛肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，正電壓時(shí)單通道電導(dǎo)是4～40 pS，在負(fù)電壓時(shí)電導(dǎo)為4～10 pS，需要注意的是，VSOR并非唯一的腫脹激活的氯通道;5)無(wú)特異性阻斷劑，VSOR最有效的阻斷劑有4，4'－二異硫氰基芪 －2，2'－二磺酸 (4，4'－diisothiocyanatostilbene－2，2'－disulfonate，DIDS)、5－硝基 －2－(3－苯丙胺)－苯甲酸[5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)－benzoic acid，NPPB]、雌激素受體拮抗劑他莫昔芬(tamoxifen)。他莫昔芬最開(kāi)始用作雌激素受體阻斷劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它能特異性地抑制Icl，vol，其他一些阻斷劑，如蒽－9－羧 酸 (anthracene－9－carboxylic acid，9－AC)、尼 氟 滅 酸(niflumic acid，NFA)、氟芬那酸 (flufenamic acid，F(xiàn)FA)、格列苯脲(glibenclamide)、IAA－94也能抑制VSOR氯通道。

2 調(diào)節(jié)作用機(jī)制

Duan等[7]通過(guò)對(duì)心臟糖蛋白、ClC－3在NIH/3T3成纖維細(xì)胞上的克隆表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了與Icl，vol一致的容量敏感度氯電流。蛋白激酶C(PKC)和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可以調(diào)節(jié)此電流，ClC－3抗體可以產(chǎn)生抑制作用。各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞容量變化通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大調(diào)節(jié)Icl，vol、PKC、酪氨酸蛋白激酶的磷酸化及細(xì)胞骨架可對(duì)其產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。在雞心臟的Icl，vol研究中，研究者發(fā)現(xiàn)抑制酪氨酸蛋白激酶可以減弱Icl，vol，經(jīng)PKC抑制劑處理的細(xì)胞在PKC激活劑作用下無(wú)Icl，vol產(chǎn)生，使用細(xì)胞松弛素B破壞絲狀肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞外低滲不能激活I(lǐng)cl，vol，說(shuō)明酪氨酸蛋白激酶、PKC、細(xì)胞骨架都是Icl，vol調(diào)節(jié)中的重要因素[8]。磷酸化在 VSOR激活中的作用還有待于證實(shí)。

Crepel等[9]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖與酪氨酸激酶激活VSOR有關(guān)。其他研究者也發(fā)現(xiàn)了酪氨酸磷酸化的作用。與此同時(shí)，Lepple－Wienhues等[10]研究發(fā)現(xiàn)，p56Ick激酶調(diào)整酪氨酸磷酸化參與了細(xì)胞容積調(diào)節(jié)過(guò)程，敲出p56Ick的細(xì)胞無(wú)法記錄到容積調(diào)控氯電流，但在轉(zhuǎn)染野生型DNA或在剪切的膜片上加入該激酶后，該電流又出現(xiàn);另外，低滲腫脹時(shí)該激酶的活性增高。有報(bào)道顯示，Icl，vol在鼠成纖維細(xì)胞，磷酸酪氨酸磷酸酶抑制劑能抑制RVD與氯電導(dǎo)[11]。研究表明，加入GTP可使Icl，vol時(shí)程延長(zhǎng)，而加入GDPβγ則抑制該電流。他們得出結(jié)論，VSOR激活機(jī)制中有G蛋白參與[12]。在胞內(nèi)ATP處于低水平時(shí)，Mg升高能抑制 Icl，vol細(xì)胞內(nèi)Cl－濃度增高時(shí)，將出現(xiàn)VSOR的激活容積增大或活性降低[13]。一些蛋白激酶通路在VSOR激活中的作用被廣泛研究。其中，cAMP和cAMP依賴的PKA磷酸化對(duì)Icl，vol的作用存在著許多爭(zhēng)議[14]。十字胞堿(STS)可能通過(guò)PI3K/Ak機(jī)制激活心肌細(xì)胞容積敏感性外向整流氯離子通道[15]。

3 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

凋亡是活體內(nèi)個(gè)別細(xì)胞的程序性死亡，是因體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致細(xì)胞主動(dòng)性死亡的形式。凋亡性細(xì)胞皺縮(AVD)，是細(xì)胞凋亡的一個(gè)普遍且重要的特征，而維持細(xì)胞體積恒定，VSOR起著重要作用[16]。當(dāng)細(xì)胞處于低滲環(huán)境中，由于滲透壓的作用，水被動(dòng)流入細(xì)胞，腫脹的細(xì)胞可激活氯離子通道開(kāi)放，從而使胞內(nèi)大量離子及水分外流，最終使細(xì)胞回復(fù)其原來(lái)的體積大小，這種細(xì)胞腫脹后發(fā)生的容積減小即調(diào)節(jié)性容積回縮。

研究表明，在小鼠心房肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，提高VSOR氯通道電流可加速RVD過(guò)程[17]。當(dāng)細(xì)胞處于高滲環(huán)境中，由于滲透壓的作用，水被動(dòng)流出細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生皺縮，為了重新達(dá)到“正?！比莘e，細(xì)胞會(huì)發(fā)生調(diào)節(jié)性容積增大(RVI)。RVI的發(fā)生主要與Na+－K+－2Cl－同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，Na+－Cl－同向轉(zhuǎn)運(yùn)體和 Na+/H+交換體等有關(guān)[18]。

已有研究表明，VSOR參與了RVI的發(fā)生，而且高滲環(huán)境中氯離子電流的減少可反映出VSOR活動(dòng)受抑制[19]。AVD的發(fā)生主要和容積調(diào)節(jié)性K+和Cl－通道的激活有關(guān)。AVD的誘導(dǎo)伴隨著RVD的易化，在此過(guò)程中總是伴隨有容積調(diào)節(jié)性K+和Cl－通道的激活，Cl－通道的活動(dòng)可能是AVD的一個(gè)必要條件。

4 與心血管疾病的關(guān)系

目前，主要認(rèn)為氧自由基、鈣超載、活化的中性白細(xì)胞、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、細(xì)胞黏附因子和細(xì)胞凋亡等都可能參與心肌缺血－再灌注損傷(MI/R)的發(fā)病過(guò)程[20]?，F(xiàn)已證實(shí)，在MI/R中存在激活VSOR，通過(guò)RVD和缺血時(shí)產(chǎn)生的親脂代謝物及細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度變化影響氯離子通道。研究發(fā)現(xiàn)，VSOR的非選擇阻滯劑DIDS或NPPB可以減少再灌注期的細(xì)胞凋亡數(shù)，但對(duì)缺血期影響不大;說(shuō)明VSOR參與了缺血－再灌注引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程的調(diào)節(jié)[21]。

氯離子通道阻滯劑DIDS具有保護(hù)MI/R損傷的作用，可減少再灌注后的心律失常、抑制心肌酶釋放和改善心臟的功能，并且在MI/R誘導(dǎo)的凋亡性心肌細(xì)胞損傷中，氯離子通道阻滯劑也能有效地抑制Caspase－3活性，保護(hù)受損的心肌細(xì)胞。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，DIDS抑制心肌細(xì)胞凋亡可能與抑制促凋亡分子Bax由胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)位有關(guān)。

5 針對(duì)VSOR發(fā)揮作用的藥理學(xué)研究

基于近年來(lái)對(duì)氯離子的深入探索，不管是基礎(chǔ)研究還是臨床研究，都說(shuō)明VSOR與人類疾病息息相關(guān)。阻斷氯離子通道會(huì)對(duì)缺血性心肌病起到保護(hù)作用，但針對(duì)其通道阻滯劑尚無(wú)特異性的藥物發(fā)現(xiàn)，其非特異阻滯劑較多，且被廣泛應(yīng)用于各種研究試驗(yàn)，不同細(xì)胞要選用不同的阻滯劑。Cl－電流參與動(dòng)作電位，阻斷其可延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程起到抗心律失常的作用，這可能成為新一代抗心律失常藥物的突破口。到目前為止，對(duì)于陰離子通道，實(shí)現(xiàn)特異性激活或阻斷并不容易。大多數(shù)氯離子通道阻滯劑或激活劑都不是高特異性的，所以使用這些阻斷劑或激動(dòng)劑必然會(huì)出現(xiàn)很多負(fù)作用。由此可見(jiàn)，通過(guò)離子通道學(xué)研究篩選高特異性阻滯劑或激動(dòng)劑是藥理學(xué)研發(fā)的焦點(diǎn)。

近年來(lái)，隨著科技的進(jìn)步，藥物分析學(xué)、化學(xué)、生理學(xué)等學(xué)科參與了中藥的研發(fā)，對(duì)中藥的認(rèn)識(shí)有了進(jìn)一步的深入[23]。中藥單體制備成為醫(yī)藥界的潮流及焦點(diǎn)，對(duì)中藥單體的研究需要借助現(xiàn)代手段和技術(shù)，根據(jù)細(xì)胞膜色譜法[24]在細(xì)胞水平篩選的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，對(duì)其中藥有效成分進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。加之臨床上多種中藥廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病，如丹參具有擴(kuò)張血管、降壓、抗血栓的作用，對(duì)冠心病、心絞痛、心動(dòng)過(guò)速有明顯療效。近年來(lái)，高效小分子組合化合物和天然化合物對(duì)VSOR功能的調(diào)節(jié)作用成為研究的熱點(diǎn)。

VSOR對(duì)維持細(xì)胞容積平衡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、影響細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞的電活動(dòng)等多種生物功能發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可能通過(guò)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活細(xì)胞膜氯離子通道，誘發(fā)細(xì)胞凋亡性容積減小，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該中藥單體也通過(guò)膜片鉗技術(shù)得到了驗(yàn)證[25]。利用氯離子通道細(xì)胞熒光測(cè)定模型和電生理測(cè)定分析，從中藥單體化合物中發(fā)現(xiàn)并研究了天然小分子化合物人參皂苷元－20(S)－原人參二醇(protopanaxadiol)對(duì)野生型和AF508突變型CFTR Cl－通道的激活作用[26－27]。

6 展望

在過(guò)去20多年中，心臟氯離子通道的研究經(jīng)歷了一次從新發(fā)現(xiàn)和快速發(fā)展的時(shí)期，無(wú)論通道功能還是調(diào)節(jié)機(jī)制方面都取得了重要進(jìn)展，但對(duì)心肌氯離子通道的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于陽(yáng)離子通道。尤其在VSOR分子結(jié)構(gòu)、基因定位研究方面，至今尚未確定。最近一項(xiàng)研究表明，TMEM16F是Ca2+激活Cl－通道的一個(gè)組成部分，但不是容積敏感性外向整流氯離子通道[28]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和膜片鉗的應(yīng)用，離子通道的結(jié)構(gòu)和功能研究可望得到進(jìn)一步發(fā)展，也必定能極大地促進(jìn)心臟氯離子通道的研究和發(fā)展。

[1]Sardini A，Amey JS，Weylandt KH，et al．Cell volume regulation and swelling － activated chloride channels[J]，Biochemica et Biophysica Acta，2003，1618(2):153 －162．

[2]Hume JR，Duan D，Collier ML，et al．Anion transport in heart[J]．Physiol Rev，2000，80(1):31 － 81．

[3]Weylandt KH，Valverde MA，Nobles M，et al．Human ClC －3 is not the swelling－ activated chloride channel involved in cell volume regulation[J]．J Biol Chem，2001，276(20):17 461 －17 467．

[4]Okada Y．Volume expansion－sensing outward－retifier Cl－channel:fresh start to the molecular identity and volume sensor[J]．Am J Physiol，1997，273(3 Pt 1):C755 － 789．

[5]Eggermont J，Trouet D，Carton I，et al．Cellular function and control of volume regulated anion channels[J]．Cell Biochem Biophys，2001，35(5):263－274．

[6]d’Anglemont de Tassiguy A，Soukani R，Ghaleh B，et al．Structure and pharmacology of swelling － sensitive chloride channels，I(C1，swel1)[J]．Fundam Clin Pharmacol，2003，17(5):539 － 553．

[7]Duan D，Cowley S，Homwitz B，et al．A serine residue in ClC －3 links phesphorylation－dephosphorylation to chloride charmel regulation by cell volume[J]．J Gen Physiol，1999，113(1)，57 － 70．

[8]Wei H，Mei YA，Sun JT，et al．Regulation of swelling－ activated chloride channels inembryonic chickheartcells[J]．CellRes，2003，13(1):21 －28．

[9]Crepel V，Panenka W，Kelly ME，et al．Mitogen － activated protein and tyrosine kinases in the activation of astrocyte volume－activated chloride current[J]．J Neurosci，1998，18(4):1 196 － 1 206．

[10]Lepple － Wienhues A，Szabo I，Laun T，et al．The tyrosine kinase p56lck mediates activation of swelling－induced chloride channels in lymphocytes[J]．J Cell Biol，1998，141(1):281 － 286．

[11]Thoroed SM，Bryan－Sisneros A，Doroshenko P．Protein phosphotyrosine phosphatase inhibitors suppress regulatory volume decrease and the volume － sensitive Cl－conductance in mouse fibroblasts[J]．Pflugers Arch，1999，438(2):133 － 140．

[12]Doroshenko P，Neher E．Volume－sensitive chloride conductance in bovine chromaffin cell membrane[J]．J Physiol，1992，449(4):197 － 218．

[13]Doroshenko P．High intracellular chloride delays the activation of the volume－sensitive chloride onductance in mouse L －fibroblasts[J]．J Physiol，1999，514(Pt 2):437 － 446．

[14]Sorota S．Swelling－induced chloride－sensitive current in canine atrial cells revealed by whole － cell patch － clamp method[J]．Circ Res，1992，70(4):679－687．

[15]Liu Y，Wang B，Zhang WW，et al．Modulation of Staurosporine－Activated Volume－Sensitive Outward Rectifying Cl－Channel by PI3K/Akt in Cardiomyocytes[J]．Curr Pharm Des，2013，19(27)4859 －4864．

[16]Okada Y，Shimizu T，M aeno E，et al．Volume－sensitive chloride channels involved in apoptotie volume decrease and cell death[J]．J Membr Biol，2006，209(1):21 － 29．

[17]Inoue H．Takahashi N，Okada Y，et al．Volume－sensitive outwardly rectifying chloride channel in white adipocytes from normal and diabetic mice[J]．Am J Physiol Cell Physiol，2010，298(4):C900 － C909．

[18]Bachmann O，Heinzmann A，Mack A，et al．Mechanisms of secretion －associated shrinkage and volume recovery in cultured rabbit parietal cells[J]．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292(3):G711－G717．

[19]Winpenny JP，Mathews CJ，Verdon B，et al．Volume － sensitive chloride currents in prim ary cultures of human fetal vas deferens epithelial cells[J]．PflugersArch，1996，432(4):644 － 654．

[20]Prasad A，Stone GW，Holmes DR，et al．Reperfusion injury，microvaseular dysfunction，and cardioprotection:the“dark side”of reperfusion[J]．Circulation，2009，120(21):2 105 － 2 112．

[21]Wang XM，Takahashi N，Uramoto H，et al．Chloride channel inhibition prevents ROS－dependent apoptosis induced by ischenmia－reperfusion in mouse cardiomyocytes[J]．Cell Physiol Biochem，2005，16(4－6):147－154．

[22]Liu AH，Cao YN，Liu HT，et al．DIDS attenuates staurosporine－induced cardiomyocyte apoptosis by PI3 K/Akt signaling pathway:activation of eNOS/NO and inhibition of Bax translocation[J]．Cell Physiol Bio Chem，2008，22(1－4):177－186．

[23]徐硯通，王 釗．后基因組時(shí)代的中藥現(xiàn)代化研究——中藥化學(xué)和中藥藥理學(xué)展望[J]．中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7(2):18－20．

[24]苗 奕，溫守明，季小慎．親和色譜法的研究進(jìn)展[J]．國(guó)外醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊(cè)，1999，26(1):41－44．

[25]李 媛，劉善文，陳麗新，等．丹參酮ⅡA對(duì)低分化鼻咽癌細(xì)胞氯通道的激活作用[J]．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(9):1 205－1 209．

[26]劉 軍，那萬(wàn)里，麻彤輝，等．20(S)－原人參二醇促進(jìn)CFTR氯離子通道開(kāi)放[J]．高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2008，4(1):731－734．

[27]Ma T，Thiagarajah JR，Yang H，et al．Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high－throughput screening blocks cholera toxin－induced intestinal fluid secretion[J]．J Clin Invest，2002，110(11):1 651－1 658．

[28]Shimizu T，lehara T，Sato K，et al．TMEM16F is a component of a Ca2+－activated Cl－channel but not a volume－sensitive outwardly rectifying Cl－channel[J]．Am J Physiol Cell Physiol，2013，304(8):C748 － C759．