microRNAs調(diào)控自噬研究進(jìn)展*

江龍洋 白雪峰 魏敏杰

自噬（Autophagy）即自體吞噬，是真核細(xì)胞中廣泛存在的生命現(xiàn)象。研究表明，多種因素諸如氧化應(yīng)激、饑餓、高溫、細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器及異常蛋白的堆積均會(huì)誘發(fā)細(xì)胞自噬。自噬過程中通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體，降解其吞入的受損細(xì)胞器和異常大分子物質(zhì)，以此維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。但過度自我消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡［1］。自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，因此，自噬的研究受到越來越多的重視。

自噬的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，參與的信號(hào)通路眾多，microRNAs通過調(diào)控自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用。已有研究證實(shí)，microRNAs在調(diào)控自噬的發(fā)生過程中，大多為抑制自噬發(fā)生，也有少部分microRNAs能激活自噬。以下分別從這兩個(gè)方面進(jìn)行敘述。

1 抑制自噬發(fā)生的相關(guān)microRNAs

1.1 miR-502

Ras家族成員Rab1B已被證實(shí)能夠通過調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸直接影響自噬。Zhai等［2］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者樣本中miR-502表達(dá)下調(diào)，在結(jié)腸癌中轉(zhuǎn)染miR-502，可通過下調(diào)Rab1B的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的發(fā)生，并能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和阻滯細(xì)胞周期。小鼠結(jié)腸癌種植瘤模型中證實(shí)，miR-502能夠抑制結(jié)腸腫瘤生長(zhǎng)，也可能是其干擾自噬的結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-502抑制自噬與5-氟尿嘧啶在治療結(jié)腸癌中有協(xié)同作用，因此基于miR-502的治療方案可能會(huì)為結(jié)腸癌的治療提供新的選擇。

1.2 miR-181a

已有研究證實(shí)，miR-181a可減弱饑餓和雷帕霉素在乳腺癌MCF-7、人類肝癌Huh-7及慢性髓原白血病K562細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬。Tekirdag等［3］研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可通過與自噬相關(guān)基因ATG5 3'UTR區(qū)域結(jié)合從而下調(diào)ATG5信使RNA和蛋白的表達(dá)，當(dāng)ATG5蛋白水平低于某一閾值時(shí)，ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物形成受阻，直接影響了隨后的LC3脂化過程，從而抑制自噬。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、胃癌和肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR-181a，能夠增強(qiáng)放射治療或化療藥物阿糖胞苷、長(zhǎng)春新堿、順鉑的治療效果。

1.3 miRNA-130a

Kovaleva等［4］報(bào)道在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中，miR-130a的表達(dá)大幅下調(diào)。其使慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中miR-130a高表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬的發(fā)生明顯減少，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ATG2B和DICER1均是miR-130a的靶基因，而ATG2B能與ATG2A和WDR45相互作用，參與自噬小體形成的起始階段，同時(shí)DICER1被證明參與了自噬發(fā)生，因此miR-130a可能是通過ATG2B和DICER1抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。此外，由于DICER1是microRNAs合成的關(guān)鍵因子，故該處可能存在對(duì)microRNAs的反饋調(diào)節(jié)作用?？梢妋iR-130a的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞自噬發(fā)生過程中扮演重要角色，為腫瘤多靶點(diǎn)治療提供參考。

1.4 miR-376b

Korkmaz等［5］在乳腺癌MCF-7、人類肝癌Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-376b后抑制了饑餓誘導(dǎo)的自噬。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LC3蛋白的表達(dá)雖未降低，但減弱了它的脂化水平，ATG4C和BECN1信使RNA及蛋白水平均下調(diào)，BECN1調(diào)控著自噬體形成的早期階段，ATG4C通過影響LC3的成熟而參與了自噬體膜的延伸過程。同時(shí)，雷帕霉素處理導(dǎo)致的miR-376b上調(diào)能夠抵消它誘導(dǎo)的自噬，并能影響其治療效果。檢測(cè)miR-367b的表達(dá)水平及自噬發(fā)生的情況，可為疾病的診斷提供依據(jù)。

1.5 miR-101

Frankel等［6］利用qPCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同途徑（饑餓、雷帕霉素和依托泊苷治療）誘導(dǎo)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬，內(nèi)源性miR-101的水平均增加，提示miR-101參與了乳腺癌MCF-7細(xì)胞的自噬過程。其發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)miR-101的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，自噬被抑制，抑制內(nèi)源性的miR-101表達(dá)可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。STMN1編碼的Stathmin已被證實(shí)參與了自噬的調(diào)節(jié)；RAB5A為一種小GTP酶，在自噬小體形成的早期階段發(fā)揮著重要作用；ATG4D是半胱氨酸蛋白酶家族的一員，經(jīng)LC3加工之后，調(diào)節(jié)自噬小體的形成。STMN1、RAB5A和ATG4D參與自噬調(diào)控的基因在轉(zhuǎn)染miR-101后表達(dá)均下調(diào)，揭示了miR-101調(diào)控自噬的機(jī)制。同時(shí)，miR-101能夠增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)4-羥他莫昔芬的敏感性，提示miR-101可能在乳腺癌的治療中具有重要價(jià)值。

1.6 miR-375

在人類肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-375后能下調(diào)自噬相關(guān)基因Atg7信使RNA及蛋白表達(dá)水平，Atg7參與LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)變所必需的Atg10和Atg12、Atg3和LC3復(fù)合物形成過程，當(dāng)Atg7下調(diào)時(shí)自噬溶酶體的形成受阻，阻斷了自噬的發(fā)生，從而避免腫瘤治療中自噬引起的耐藥。因此提高miR-375的表達(dá)與能夠誘導(dǎo)自噬的化療藥物如索拉菲尼聯(lián)合運(yùn)用，可增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用，開發(fā)一種更為有效且安全的惡性腫瘤治療方法還有待研究［7-8］。

1.7 miR-204

Mikhaylova等［9］通過檢測(cè)觀察，與正常腎組織標(biāo)本相比，腎透明細(xì)胞癌患者腎組織標(biāo)本中miR-204的水平顯著下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-204能夠抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而應(yīng)用自噬上游抑制劑3-甲基鳥嘌呤后，miR-204引起細(xì)胞的死亡過程被阻斷，該結(jié)果表明miR-204可能是通過抑制自噬影響腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。免疫熒光染色和免疫印跡結(jié)果均顯示，miR-204是通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞LC3B的表達(dá)，抑制了自噬的發(fā)生，而對(duì)正常腎細(xì)胞影響較小，為今后將miR-204運(yùn)用于腎腫瘤的治療提供了可能性。Jian等［10］在心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的自噬中，同樣證實(shí)miR-204通過下調(diào)LC3B抑制自噬的進(jìn)程，保護(hù)心肌細(xì)胞免于缺氧復(fù)氧造成的損傷。

1.8 miR-30family

miR-30家族廣泛參與正常生理過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、衰老和凋亡，也參與腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程［11］。其中miR-30a和miR-30d在自噬的調(diào)控中作用重大，Yang等［11］在5株不同來源的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-30d后，自噬相關(guān)基因ATG5、ATG12、BECN1和BNIP3L的mRNA及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，從而抑制自噬的進(jìn)程。miR-30a在自噬方面的研究較多，Xu等［12］研究提示風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑液組織中自噬活性的增加，可能是miR-30a下調(diào)的結(jié)果。Zou等［13］同樣證實(shí)，miR-30a通過抑制BECN1介導(dǎo)的自噬能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順氯氨鉑的敏感性，從而增強(qiáng)該類DNA損傷藥物的治療效果。Yu等［14］在慢性粒細(xì)胞白血病的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-30a通過下調(diào)BECN1和ATG5的表達(dá)抑制自噬，從而增加伊馬替尼的細(xì)胞毒性作用并促進(jìn)線粒體依賴內(nèi)在細(xì)胞凋亡。

microRNAs除了調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的的自噬，在缺血-再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。Xiao等［15］研究提示，在缺血-再灌注中miR-204下調(diào)與LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)同時(shí)發(fā)生，而LC3-Ⅰ的表達(dá)無明顯變化，提示miR-204可能通過調(diào)節(jié)LC3-Ⅱ的表達(dá)介導(dǎo)了心肌缺血-再灌注損傷中自噬的發(fā)生。因此，調(diào)控心肌細(xì)胞中miR-204的表達(dá)水平，或許能避免缺血-再灌注過程中對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。Wu等［16］也在研究中證實(shí)，miR-20a和miR-106b可下調(diào)ULK1的表達(dá)，抑制成肌細(xì)胞C2C12亮氨酸缺乏誘導(dǎo)的自噬。

除了上述 microRNAs，miRNA hsa-let-7g、miR-199a-5p、miR-212/132家族在抑制自噬的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用［17-19］。由于每一種microRNA均具有多個(gè)靶基因，因此其作用靶點(diǎn)的多樣性，決定了其在自噬調(diào)控過程中的復(fù)雜性，現(xiàn)已觀察到的自噬現(xiàn)象很可能是調(diào)控多個(gè)靶基因后的共同結(jié)果。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，microRNAs抑制自噬的發(fā)生，多是通過下調(diào)自噬小體形成過程的關(guān)鍵分子，如自噬相關(guān)基因、LC3、BECN1等，進(jìn)而抑制自噬小體的形成和自噬體膜的延生等過程，主要抑制自噬的早期階段。因此，可利用microRNAs抑制自噬，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤化療過程中自噬引起的耐藥，為腫瘤臨床治療提供新的途徑。

2 促進(jìn)自噬發(fā)生的相關(guān)microRNAs

2.1 miR-199a-5p

Xu等［18］在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)miR-199a-5p低表達(dá)，并且轉(zhuǎn)染miR-199a-5p后能夠抑制順鉑誘導(dǎo)自噬的激活。而Yi等［20］則認(rèn)為在輻射誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬中，miR-199a-5p扮演著不同的角色。DRAM1已被證實(shí)有促進(jìn)自噬的作用，BECN1也被普遍認(rèn)為是自噬啟動(dòng)所需的關(guān)鍵基因，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞，過表達(dá)miR-199a-5p導(dǎo)致DRAM1和BECN1表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制自噬；而在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，結(jié)果恰好相反，過表達(dá)miR-199a-5p后，DRAM1和BECN1表達(dá)水平增加，熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-199a-5p能夠與DRAM1和BECN1的3'UTR結(jié)合，有趣的是，與常見microRNA的作用結(jié)果相反，該結(jié)合上調(diào)了DRAM1和BECN1的表達(dá)。同時(shí)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值也增加，均提示miR-199a-5p促進(jìn)了乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的自噬。

2.2 miR-7

通過在肺癌細(xì)胞H1299和A549中高表達(dá)miR-7，能抑制細(xì)胞的增殖，這種抑制作用與凋亡無關(guān)，而是通過下調(diào)EGFR和p62的表達(dá)水平，解除了EGF對(duì)自噬的抑制，從而激活自噬介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡。而已有報(bào)道證實(shí)，在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-7是通過凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此miR-7誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的類型與腫瘤細(xì)胞的來源和類型相關(guān)［21］。

2.3 miR-519

Abdelmohsen等［22］在研究中發(fā)現(xiàn)，向Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-519后胞漿出現(xiàn)大量空泡結(jié)構(gòu)，通過電鏡觀察形態(tài)、免疫印跡分析LC3Ⅰ及LC3Ⅱ表達(dá)水平和熒光顯微鏡觀察GFP-LC3的表達(dá)和形態(tài)，均提示自噬的激活。進(jìn)一步研究證實(shí)，p21在miR-519觸發(fā)的自噬過程中起著核心作用。

2.4 miR-375

前文已提及miR-375在人類肝癌細(xì)胞中能夠抑制自噬的發(fā)生［7-8］，而 Yang等［23］利用 TaqMan 微小RNA芯片檢測(cè)多柔比星處理的慢性髓原白血病K562細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-375表達(dá)上調(diào)幅度最大，在多柔比星處理的慢性髓原白血病K562細(xì)胞中過表達(dá)miR-375能夠上調(diào)自噬相關(guān)基因ATG9B和ATG18的表達(dá)，即miR-375能夠激活多柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老過程中自噬的發(fā)生。

由此可見，microRNAs促進(jìn)自噬的發(fā)生主要通過兩種途徑：一方面可通過下調(diào)抑制自噬信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，解除該通路對(duì)自噬的抑制作用，進(jìn)而激活自噬；另一方面可通過上調(diào)自噬相關(guān)基因、LC3、BECN1等，直接影響自噬小體的形成，從而激活自噬。

自噬的激活，多與腫瘤細(xì)胞對(duì)放療化療產(chǎn)生抵抗相關(guān)，降低治療效果。在放化療治療過程中，腫瘤細(xì)胞通過自噬，清除腫瘤細(xì)胞內(nèi)放化療損傷的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)，并為殘存的腫瘤細(xì)胞提供能量，參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥過程。

綜上所述，microRNAs對(duì)自噬的的調(diào)節(jié)因作用的靶點(diǎn)和方式的差異，對(duì)自噬起到抑制和激活兩個(gè)方面的作用。當(dāng)microRNAs下調(diào)自噬相關(guān)蛋白，并最終影響自噬小體形成時(shí)，就會(huì)抑制自噬；當(dāng)microRNAs上調(diào)自噬相關(guān)蛋白，或解除抑制自噬的信號(hào)通路作用時(shí)，就會(huì)激活自噬。其中microRNAs上調(diào)目的基因表達(dá)的作用機(jī)制還有待于研究。適當(dāng)?shù)睦米允稍谀[瘤中的雙刃劍作用，抑制有害的自噬，誘導(dǎo)有益的自噬，均可提高放化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

3 展望

microRNAs通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)方式，調(diào)節(jié)體內(nèi)各種蛋白的表達(dá)水平，廣泛參與生物體的生命過程。自噬為真核生物中普遍的生命現(xiàn)象，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用。自噬的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制正越來越多的被人們認(rèn)識(shí)，microRNAs對(duì)自噬的研究現(xiàn)處于起步階段，還有許多機(jī)制尚未闡明，另外，更多能夠調(diào)控自噬的microRNAs還有待于發(fā)現(xiàn)。正確的利用自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，對(duì)今后更好的治療和預(yù)防癌癥有著重要的指導(dǎo)意義。microRNAs在腫瘤中的作用還處于研究階段，要將其運(yùn)用于臨床還需要更多的研究來支持。同時(shí)microRNAs本身作為一種核酸，在其運(yùn)用于臨床時(shí)，還需要考慮生物污染和倫理道德等問題。通過microRNAs調(diào)控自噬在控制癌癥、延緩衰老、提高生存質(zhì)量等方面的作用還有待于進(jìn)一步研究，調(diào)控自噬發(fā)生發(fā)展或?yàn)榕R床治療提供新策略。

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