Rep-PCR技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)狀

趙燕梅，張吉明，許慶方

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801）

Rep-PCR技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)狀

趙燕梅，張吉明，許慶方

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801）

文章著重介紹了Rep-PCR技術(shù)原理、特點(diǎn)及其在細(xì)菌、真菌、環(huán)境微生物遺傳多樣性研究方面的應(yīng)用。Rep-PCR目前發(fā)展迅速并被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌基因分類(lèi)，此方法操作方便，可以大樣本進(jìn)行，且Rep-PCR分辨效果好，可重復(fù)性強(qiáng)。現(xiàn)在Rep-PCR可自動(dòng)化分型，并可建立各種細(xì)菌REP、ERIC-PCR分型標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)。但Rep-PCR也存在一定問(wèn)題，不同來(lái)源的或不同批次的引物和酶，對(duì)Rep-PCR結(jié)果都有一定的影響。

Rep-PCR；細(xì)菌；真菌；環(huán)境微生物；遺傳多樣性

1 Rep-PCR

細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR（repetitive extragenic palindromic PCR，Rep-PCR）是由 Versalovic于 1991年描述的一種細(xì)菌基因組指紋分析方法。該方法是通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，來(lái)揭示基因組間的差異。細(xì)菌的重復(fù)序列是一類(lèi)在維護(hù)基因組DNA結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化方面起重要作用的高度保守的DNA序列，在細(xì)菌基因組中廣泛分布，約占細(xì)菌基因組的5%［1］。在不同種細(xì)菌或同種不同菌株中，重復(fù)序列單元的數(shù)量和在染色體上的分布各具特點(diǎn)。這些序列單元的功能大部分尚未明確，但最新研究表明，它們可能參與RNA或DNA的合成與代謝［2］，也可能與細(xì)菌基因組的進(jìn)化有關(guān)［3］。當(dāng)前，在多態(tài)性研究中應(yīng)用較多的重復(fù)序列有（GTG）5序列、REP序列（repetitive extragenic palindromic，REP，35～40 bp）、ERIC序列（enterobaeterial repetitive intergenic consensus，ERIC，124～127 bp） 以 及 BOX序 列（154 bp）等［4-5］。這些重復(fù)序列分布在細(xì)菌基因組上的不同位點(diǎn)并以不同的距離分隔，存在菌株和種屬水平上的差異。如果以細(xì)菌的基因組DNA作為模板，這些重復(fù)序列作為引物進(jìn)行PCR，重復(fù)序列都是特定的，因此可用來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和多樣性研究［6］。Rep-PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要有：①分辨率高；②實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低；③適于高流通量菌株；④對(duì)許多革蘭氏陰性菌和一些陽(yáng)性菌的鑒定很可靠；⑤快速、易于操作、重復(fù)性好［7］。Rep-PCR目前可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，并可建立相應(yīng)菌種的REP、ERIC-PCR分型數(shù)據(jù)庫(kù)，以備比對(duì)鑒定之用。Rep-PCR目前主要應(yīng)用于細(xì)菌，其中乳酸菌方面主要集中在雙歧桿菌（Bifidobacteri－um）、芽孢桿菌（Sporolactobacillus）、乳桿菌（Lactobacillus）、腸球菌（Enterococcus）等多態(tài)性的研究中。

2 Rep-PCR技術(shù)原理

Rep-PCR技術(shù)的原理是利用特定的引物擴(kuò)增細(xì)菌基因組DNA的重復(fù)序列，這些序列在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，擴(kuò)增位于這些序列之間的不同區(qū)域可得到不同的圖譜，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳便可以分析其多態(tài)性。

Rep-PCR通常有5種方法用于不同細(xì)菌的基因分型。這 5種方法分別為 Rep-PCR，ERIC-PCR，ERIC2-PCR，BOX-PCR，其設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度一般為15～22 bp。REP-PCR引 物 ：Rep1R-I（5′-III ICG ICG ICA TCI GGC-3′）和 Rep2-I（5′-ICG ICTTATCIGGCCTAC-3′）；ERIC-PCR：ERIC1R（5′-ATG TAA GCTCCTGGGGAT TCA C-3′） 和 ERIC2（5′-AAG TAA GTG ACTGGGGTG AGCG-3′）；ERIC2-PCR：ERIC2（5′-AAG TAA GTG ACT GGGGTGAGCG-3′）；BOX-PCR：BOXA1R（5′-CTACGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3′）；（GTG）5-PCR：（GTG）5（5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′）［8］。不同的文獻(xiàn)使用的引物可能不一樣，除了用Rep1R-I和Rep2-I引物外，還使用了（GTG）5引物對(duì)乳桿菌的一些種進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用（GTG）5引物得到的多態(tài)性更高。PCR產(chǎn)物可用1%～3%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

3 Rep-PCR應(yīng)用現(xiàn)狀

Rep-PCR技術(shù)的分辨率雖沒(méi)有脈沖凝膠電泳高，但此方法更簡(jiǎn)單快捷、經(jīng)濟(jì)方便，也可提供大的信息量。Rep-PCR方法在微生物分類(lèi)鑒定、菌株的分型、親緣關(guān)系和分子微生物生態(tài)學(xué)研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 Rep-PCR在細(xì)菌遺傳多樣性研究方面的應(yīng)用

滿朝新等［9］采用了Rep-PCR指紋圖譜技術(shù)，對(duì)分離自內(nèi)蒙古通遼地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的乳酸菌（Lactobacillus）進(jìn)行了鑒定和多樣性分析。發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Rep-PCR指紋圖譜技術(shù)能夠?qū)?shí)驗(yàn)菌株達(dá)到非常好的分辨能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該地區(qū)的乳酸菌呈現(xiàn)出非常高的多樣性，其中植物乳桿菌（L.plantarum）和瑞士乳桿菌（L.Helveticus）等6種菌種是這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳中常見(jiàn)的菌種，而植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)種；而且還發(fā)現(xiàn)同一乳酸菌種群指紋圖譜存在一些特征性的條帶，為快速鑒定乳酸菌提供了理論依據(jù)。李潔等［10］對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）、普通變形桿菌（Proteusvulgaris）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）基因組DNA進(jìn)行Rep-PCR擴(kuò)增，并在模板樣品中混入植物DNA作對(duì)照，結(jié)果表明，用Rep-PCR方法分析細(xì)菌基因多樣性，能在較大范圍內(nèi)避免植物基因的干擾。鄭曉麗等［11］采用Rep-PCR技術(shù)對(duì)分離得到的34株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，盡管Rep-PCR分型方法只能將34株產(chǎn)氣莢膜梭菌分為7個(gè)亞型，但是，仍然表現(xiàn)出對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株較高的鑒別能力，不失為一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的產(chǎn)氣莢膜梭菌分型方法。林海云等［12］運(yùn)用Rep-PCR技術(shù)對(duì)84株不同寄主的青枯雷爾氏菌株（ralstonia solanacearum）進(jìn)行基因多樣性研究，基于所擴(kuò)增出的基因指紋圖譜表明，Rep-PCR擴(kuò)增出20條特異性條帶，即Rep-PCR多態(tài)性分析技術(shù)可為我國(guó)青枯雷爾氏菌基因多樣性的研究提供另一條途徑。李偉偉等［13］應(yīng)用Rep-PCR方法追蹤淮河流域某水庫(kù)糞便污染的來(lái)源。此方法能較好地區(qū)分水體中大腸桿菌的不同來(lái)源，為水體治理提供了依據(jù)。許龍巖等［14］應(yīng)用Rep-PCR方法對(duì)副溶血性弧菌（VibrioParahemolyticus）進(jìn)行分型研究，結(jié)果表明Rep-PCR對(duì)此菌具有很好的分型效果。

3.2 Rep-PCR在真菌遺傳多樣性研究方面的應(yīng)用

何培新等［15］研究了Rep-PCR技術(shù)在平菇（Pleurotus spp.）栽培菌株分類(lèi)鑒定中的應(yīng)用。結(jié)果表明，Rep-PCR技術(shù)對(duì)供試平菇菌株擴(kuò)增出的條帶清晰，重復(fù)性好，多態(tài)性高。周金鳳等［16］采用ERIC-PCR技術(shù)對(duì)19個(gè)白靈菇（P.nebrodensis）和杏鮑菇（P.eryngi）的栽培菌株擴(kuò)增并分析它們之間的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，ERIC-PCR技術(shù)可以很好地區(qū)分這兩個(gè)菌種。Alves等［17］應(yīng)用BOX-PCR、Rep-PCR、ERIC-PCR技術(shù)對(duì)葡萄樹(shù)上分離的病原真菌進(jìn)行指紋圖譜分析，BOX-PCR Rep-PCR和ERIC-PCR顯示的條帶表明，Rep-PCR分子技術(shù)可區(qū)分種間差異，也可揭示種內(nèi)差異。

3.3 Rep-PCR在環(huán)境微生物中的應(yīng)用

吳清平等［18］采用ERIC-PCR技術(shù)對(duì)來(lái)自不同環(huán)境的20種菌株進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果顯示每種菌株均有獨(dú)特的帶型，此法在對(duì)環(huán)境細(xì)菌鑒定方面有很大實(shí)用價(jià)值。鐘召兵等［19］采用Rep-PCR方法對(duì)雞舍環(huán)境內(nèi)不同地點(diǎn)分離出的金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）進(jìn)行基因圖譜分析，比較相互間的遺傳相關(guān)性，為有效控制畜禽疾病的流行提供科學(xué)依據(jù)。Raiabi等［20］用DiversiLab系統(tǒng)、Rep-PCR技術(shù)評(píng)價(jià)薩旺尼河上的腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis）的遺傳相似性，建立沙門(mén)氏菌（Salmonella）的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以為日常監(jiān)測(cè)和將來(lái)爆發(fā)事件的來(lái)源追蹤提供參考依據(jù)。胡婧［21］通過(guò)Rep-PCR方法，分析牛舍環(huán)境中不同來(lái)源的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic E.coli）和沙門(mén)氏菌的同源性，為控制與干預(yù)產(chǎn)毒素大腸桿菌和沙門(mén)氏菌提供依據(jù)，也為建立牛場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)測(cè)管理體系提供理論基礎(chǔ)。

4 Rep-PCR存在的問(wèn)題和展望

Rep-PCR方法在研究細(xì)菌分類(lèi)、細(xì)菌親緣關(guān)系和分子微生物生態(tài)學(xué)方面應(yīng)用很廣泛，它能有效區(qū)分細(xì)菌種、屬及菌株間的差異，并能對(duì)新發(fā)現(xiàn)的菌株和已知菌株作進(jìn)一步分析，追蹤其污染源。Rep-PCR方法今后將會(huì)成為細(xì)菌鑒別、細(xì)菌分型、細(xì)菌親緣關(guān)系和細(xì)菌分子遺傳分析的有力工具［22］，且此方法快速而簡(jiǎn)單，對(duì)用于大規(guī)模流行病學(xué)的研究具有可行性［23］。Rep-PCR方法雖應(yīng)用前景很廣闊，但也存在一定問(wèn)題。Rep-PCR指紋分析技術(shù)可以反映出菌株間基因組中存在差異，但該技術(shù)不一定能反映出細(xì)菌間質(zhì)粒DNA上的差異；不同來(lái)源的或不同批次的引物和酶，對(duì)Rep-PCR結(jié)果都有一定的影響［24］；樣品處理和提取DNA的過(guò)程都會(huì)影響PCR技術(shù)的重復(fù)性、準(zhǔn)確性和特異性［25］；另外，PCR儀自身的不穩(wěn)定因素，也可導(dǎo)致PCR反應(yīng)在擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)偏差和錯(cuò)誤。

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Application Statusof Rep-PCR Technology

Zhao Yan-mei，Zhang Ji-ming，Xu Qing-fang
（CollegeofAnimalScienceand Technology，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China）

This paper focuses on the principle，characteristics of Rep-PCR and its applications in bacteria，fungi，environmental microbialgenetic diversity.Rep-PCR hasbeen developed rapidly and applied widely in gene classification ofbacteria，fungi，environmentalmicrobial.Themethod can analyse large samplewith conveniently.Besides，the Rep-PCR has a good resolution and repeatability.Currently，Rep-PCR is available to automatic classification，and establishing classification standard database of REP，ERIC-PCR.But Rep-PCR also has some problems，different sources or different batches of primers and enzymes have a certain influenceon the resultofRep-PCR.

Rep-PCR；bacteria；fungi；environmentalmicrobial；genetic diversity

Q3-3

A

2095-3887（2014）03-0055-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.03.018

2014-02-17

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303061）；山西省科技攻關(guān)計(jì)劃（20100311052）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD17B02）

趙燕梅（1990-），女，碩士研究生。

許慶方。