小反芻獸疫疫苗研究進(jìn)展

王 凡，智曉瑩，董金杰，常艷燕，劉學(xué)榮

（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州 730046）

小反芻獸疫疫苗研究進(jìn)展

王 凡，智曉瑩，董金杰，常艷燕，劉學(xué)榮

（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，蘭州 730046）

小反芻獸疫是由小反芻獸疫病毒引起的一種嚴(yán)重的烈性、接觸性重大跨國(guó)動(dòng)物疫病。目前，該病在我國(guó)已經(jīng)發(fā)生，給我國(guó)畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。同多數(shù)病毒性疾病的防制相同，對(duì)小反芻獸疫PPRS的防制仍以疫苗免疫預(yù)防為主。文章對(duì)小反芻獸疫的各類疫苗進(jìn)行綜述，以期為疫苗的合理應(yīng)用提供技術(shù)幫助。

小反芻獸疫；小反芻獸疫病毒；疫苗

小反芻獸疫（PPR），又名小反芻獸偽牛瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病。主要感染小反芻動(dòng)物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。OIE將其列為A類疫?。?］。小反芻獸疫病毒（PPRV）屬于副黏病毒科麻疹病毒屬。和其他麻疹病毒屬成員的致病性相似，PPRV最容易在動(dòng)物的上皮組織和淋巴組織中復(fù)制。2～3 d就可導(dǎo)致病毒血癥，病毒擴(kuò)散至全身各處的淋巴器官、消化系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)的黏膜繼續(xù)增殖，4～6 d后出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀［2］。目前對(duì)PPR尚無(wú)有效的治療措施，因此對(duì)PPR的預(yù)防就顯得尤為重要，市場(chǎng)上現(xiàn)在主要銷售的是滅活疫苗和弱毒苗，基因工程疫苗在實(shí)驗(yàn)室研究也取得長(zhǎng)足進(jìn)展，但要想投入生產(chǎn)還需大量的臨床試驗(yàn)，因而，急需生產(chǎn)出安全高效的新型疫苗來(lái)預(yù)防PPR的流行。

1 滅活苗

同源的PPR滅活疫苗通常使用感染PPRV山羊的病理組織進(jìn)行制備。研究表明，氯仿的滅活效果優(yōu)于甲醛，用氯仿滅活后免疫動(dòng)物，血清抗體可持續(xù)8個(gè)月，但無(wú)法區(qū)分野毒株和疫苗株。

2 弱毒苗

和滅活苗相比，弱毒苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、更有效。

2．1 RPV弱毒疫苗

以前多以RPV弱毒疫苗防制PPR［3］，是因?yàn)镽PV和PPRV位于同一病毒屬，基因組和蛋白序列具有同源性，并且臨床試驗(yàn)證明能夠產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。隨著OIE實(shí)施消滅牛瘟的全球計(jì)劃后，多數(shù)國(guó)家禁止了該疫苗的接種［4］。

2．2 PPR弱毒疫苗

2.2.1 PPRV Nigeria 75/1疫苗 商品化的Nigeria 75/1疫苗免疫接種后，動(dòng)物并不會(huì)通過(guò)直接接觸的方式傳播給同群動(dòng)物，產(chǎn)生的中和抗體至少能夠持續(xù)3年，基本上可以在羊的整個(gè)生產(chǎn)期內(nèi)提供完全的免疫保護(hù)，并且產(chǎn)生

的抗體還能夠保護(hù)山羊抵抗RPV的感染［5］。

2.2.2 PPRV Sungri/96疫苗 印度獸醫(yī)研究院（IVRI）運(yùn)用Sungri/96在Vero細(xì)胞上傳代致弱研制成了PPRV弱毒疫苗，該疫苗能適用于亞洲各個(gè)國(guó)家進(jìn)行PPR的防控［4］。Sungri/96分離株適應(yīng)Vero后傳至59代時(shí)喪失致病力。IVRI生產(chǎn)的Sungri/96弱毒苗在印度已經(jīng)大規(guī)模使用，其能夠提供至少6年的免疫保護(hù)，對(duì)印度次大陸控制譜系IV型PPRV的流行發(fā)揮了重要作用。

2.2.3 PPRVArasur/87疫苗和PPRVCoimbatore/97疫苗Tanuvas等將PPRV Arasur 87（綿羊源）和Coimbatore 97（山羊源）致弱［6］，研發(fā)出繼Nigeria 75/1和Sungri/96之后制備的另外兩株疫苗株。這兩株病毒接種細(xì)胞后產(chǎn)生的CPE與Sungri/96株有所不同，但發(fā)現(xiàn)兩者免疫動(dòng)物后都是安全有效的。該產(chǎn)品在印度南部地區(qū)被廣泛使用。

3 多聯(lián)疫苗

3.1 小反芻獸疫—山羊痘二聯(lián)疫苗

與PPR一樣，山羊痘（GP）也是OIE規(guī)定的爆發(fā)后必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病。IVRI將在Vero細(xì)胞系致弱的GP（綿羊源）和PPR的弱毒制成了二價(jià)苗，經(jīng)試驗(yàn)證明該疫苗是安全有效的。一株具有SPV和GP交叉保護(hù)性的中間毒株被推薦為疫苗株，試驗(yàn)證明此二價(jià)苗中兩種病原并不會(huì)相互干擾，對(duì)兩種疾病可以產(chǎn)生完全保護(hù)，能夠在同一地區(qū)用于PPR和GP的防控［7］。

3.2 小反芻獸疫—綿羊痘二聯(lián)疫苗

將綿羊痘Romanian Fanar疫苗株和PPRV的Sungri/96株低溫凍干后制成的二聯(lián)苗，按103TCID50的劑量皮下注射綿羊，1個(gè)月內(nèi)并沒(méi)有毒副反應(yīng)，且SPV的特異性抗體能夠通過(guò)間接ELISA方法和血清中和試驗(yàn)檢測(cè)出，PPRV的特異性抗體能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法和血清中和試驗(yàn)測(cè)出。免疫30 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，免疫組能抵抗兩種病原野毒的感染，對(duì)照組則表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，并且能夠檢測(cè)出野毒病毒［8］。該小反芻獸疫—綿羊痘二聯(lián)疫苗能夠應(yīng)用于臨床對(duì)小反芻獸疫和綿羊痘進(jìn)行防控。

4 活載體疫苗

隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，基因重組技術(shù)為開(kāi)發(fā)重組載體疫苗提供了技術(shù)支持。病毒、細(xì)菌、噬菌體等都可用來(lái)生產(chǎn)小反芻獸疫活載體疫苗。腺病毒、痘病毒、偽狂犬病病毒等是常用的病毒載體。

4.1 RPV重組活載體疫苗

將RPV的H和F基因重組于VACV活載體中，牛瘟病毒的痘苗重組疫苗免疫山羊后，經(jīng)中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)檢測(cè)，只存在RPV的中和抗體，并無(wú)PPRV的抗體，但是山羊卻能夠抵抗PPRV的感染［9］。無(wú)PPRV中和抗體的情況下能夠抵御PPRV的感染，說(shuō)明RPVH蛋白和F蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生記憶性細(xì)胞免疫應(yīng)答，在病毒清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用。山羊免疫RPVH蛋白或者F蛋白重組的羊痘病毒載體疫苗后，均能夠抵抗PPRV。但經(jīng)檢測(cè)只有H蛋白的重組疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生RPV中和抗體，F(xiàn)基因并無(wú)RPV中和抗體的產(chǎn)生［10］。這兩種重組疫苗在RPV自然宿主--牛上有同樣的試驗(yàn)結(jié)果，這種結(jié)果同樣說(shuō)明RPVH蛋白和F蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生記憶性細(xì)胞免疫應(yīng)答。

4.2 PPRV重組活載體疫苗

PPRV F基因的重組山羊痘病毒疫苗能夠刺激山羊產(chǎn)生免疫保護(hù)性，免疫劑量低至0.1 pfu時(shí)，也能夠抵抗PPRV和羊痘病毒野毒的感染［11］。這種單一的F基因重組疫苗存在免疫保護(hù)期較短的缺陷。Chen等［12］通過(guò)試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該疫苗1頭份的免疫劑量能夠使免疫期達(dá)6個(gè)月。

PPRV的H基因和RPV的H基因分別克隆到帶CMV啟動(dòng)子的桿狀病毒表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物CV-1細(xì)胞后，目的蛋白得到了瞬時(shí)表達(dá)。PPRV H蛋白具有凝集素和神經(jīng)氨酸酶活性，但是RPVH蛋白只有神經(jīng)氨酸酶活性。同樣的方法真核表達(dá)PPR V和RPV的F蛋白，發(fā)現(xiàn)PPRV F蛋白具有融合和半融合的活性，而RPVF蛋白只有半融合活性，只有與H蛋白同時(shí)存在時(shí)其融合活性才能發(fā)揮［13］。

Sinnathamby等用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PPRVH蛋白免疫山羊，接種后既發(fā)生了體液免疫，也產(chǎn)生了細(xì)胞免疫，產(chǎn)生的抗體既能中和PPRV，又能中和RPV［14］。

Rahman等將PPRV F蛋白和RPV H蛋白免疫功能區(qū)片段的編碼基因插入到家蠶核型多角體病毒（BmNPV）囊膜糖蛋白GP64編碼序列中，使得PPRVF蛋白和RPV的H蛋白能夠與GP64融合表達(dá)，在BmNPV囊膜表面和被感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上都有F和H蛋白抗原表位的正確展示。該重組病毒免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)PPRV和RPV的免疫反應(yīng)［15］。

重組PPRVF蛋白可以在家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)，對(duì)其免疫效果的研究結(jié)果表明:夾心ELISA的多抗與該重組蛋白并不反應(yīng)，但與細(xì)胞培養(yǎng)收集的病毒及病料反應(yīng)為陽(yáng)性。山羊口服表達(dá)重組F蛋白的家蠶幼蟲(chóng)或注射提取液后，均不能產(chǎn)生體液免疫，競(jìng)爭(zhēng)和間接ELISA都沒(méi)有檢測(cè)到抗體，但在56 d內(nèi)，免疫的血清能夠?qū)PRV產(chǎn)生中和反應(yīng)，這也許是因?yàn)镕蛋白主要引起機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答［16］。

RPV的H蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草和花生中都能夠獲得表達(dá)。小鼠腹腔內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因植物葉片提取物后能產(chǎn)生高滴度的抗體。小鼠和牛飼喂該轉(zhuǎn)基因植物后，能夠產(chǎn)

生高滴度的抗RPV的IgG和IgA，并且有明顯的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)［17］。PPRV的H基因和F基因的轉(zhuǎn)基因植物同樣具有免疫保護(hù)性，印度科學(xué)家將H基因轉(zhuǎn)入木豆中能夠產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的蛋白，經(jīng)檢測(cè)該重組蛋白具有神經(jīng)氨酸酶活性［18］。Khandelwal將PPRVH蛋白在轉(zhuǎn)基因花生中成功得到了表達(dá)，并且該植物是可以傳代的。在不加入任何粘膜佐劑的情況下，機(jī)體能夠產(chǎn)生高滴度的中和抗體，可見(jiàn)該可飼疫苗具有良好的應(yīng)用潛力［19］。孫娟等［20］以pBI121為載體，成功構(gòu)建了5種表達(dá)小反芻獸疫病毒H、F基因苜的蓿表達(dá)載體。

5 通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)研制的疫苗

研究人員通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)分別構(gòu)建了表達(dá)小反芻獸疫病毒F和H基因的山羊痘病毒活載體疫苗，目的在血清學(xué)上區(qū)分小反芻獸疫疫苗株和野毒株。針對(duì)小反芻獸疫病毒N蛋白抗體，若在接種重組疫苗的山羊血清中檢測(cè)到小反芻獸疫病毒N蛋白的抗體，則說(shuō)明羊群感染了野毒［21］。接種這種重組疫苗的羊不但能預(yù)防小反芻獸疫病毒的感染，而且能預(yù)防羊痘病毒的感染。陳偉業(yè)等［22］研究表明，重組山羊痘病毒候選疫苗株的1次免疫即可誘導(dǎo)明顯的抗體反應(yīng)，可提供更加全面、持續(xù)的免疫保護(hù)，這對(duì)存在一定程度基因變異的流行野毒株具有更大的意義。

6 前景與展望

從以上研究可以看出，PPR疫苗己成為當(dāng)下研究的熱門(mén)領(lǐng)域。新興的基因工程疫苗在實(shí)驗(yàn)室研究中取得了飛躍性的進(jìn)展，為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但研制安全高效的PPR疫苗仍存在很多問(wèn)題，如病毒的易變異性，保護(hù)性抗原的不確定性，活載體的不穩(wěn)定性，免疫效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)不健全等，未來(lái)PPR疫苗的發(fā)展仍然艱辛。希望通過(guò)研究人員的不懈努力，在不久的將來(lái)能夠用高效的疫苗控制PPR的流行。

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Progress in Vaccine Research of Peste Des Petits Ruminants

WangFan，Zhi Xiao-yin，Liu xue-rong，et al
（China Agricultural Veterinarian BiologyScience and TechnologyCo.Ltd，Lanzhou 730046，China）

Peste des petits ruminants（PPR）is an acute and highly contagious viral disease of small ruminants with high rate of morbidity and sometimes high rate of mortality.At present,the disease has occurred in our country，and caused heavy economic loss.Bynow，the vaccine immunization is still the main measure toprevent and control the outbreak of the disease.Therefore,this paper mainlyreviewed the research advance in PPRSvaccine at home and abroad.

peste des petits ruminants（PPR）；peste des petits ruminants virus（PPRV）；vaccine

S855．3

A

2095-3887（2014）03-0058-04

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．019

2014-04-03

甘肅省科技支撐計(jì)劃（1104NKCA081）和（1204NKCA092）

王凡（1979-），女，助理研究員，碩士。

劉學(xué)榮（1977-），男，副研究員，碩士，主要從事獸用生物制品研究。