結(jié)腸息肉樣早癌患者早期血清炎癥因子變化

張 利 吳慧麗 姚俊芳 李琨琨 肖興國

河南省鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化一科，河南鄭州 450007

大腸癌在我國發(fā)病率位居居第3位，其大多具有明確的癌前病變期(如大腸腺瘤樣息肉)，且早期無癥狀或癥狀不典型，就診的臨床病例多為中晚期，而且其治療效果和預(yù)后均不理想[1]，是全國重點防治的8種癌癥之一，進(jìn)行早期診斷和綜合防治[2]是關(guān)鍵。國內(nèi)有類似相關(guān)研究，均是對中晚期結(jié)腸癌等相關(guān)血液指標(biāo)研究，結(jié)腸早癌的相關(guān)研究少[3]。

該研究通過對我院350例結(jié)腸息肉樣病變患者，電子結(jié)腸鏡下行粘膜切除（EMR）或剝離（ESD）后病理學(xué)檢查證實結(jié)腸早癌120例，與單純結(jié)腸腺息肉病組230例，正常結(jié)腸鏡結(jié)腸粘膜200例，檢測血液中促炎因子、抑炎因子、抑癌基因水平，進(jìn)行比較分析，為結(jié)腸早癌篩查及診斷提供臨床指導(dǎo)，同時對結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸早癌的發(fā)生機制進(jìn)行初步分析、探討。

1 入選標(biāo)準(zhǔn)、材料與方法

1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)及分組

入選標(biāo)準(zhǔn)：選取2010年2月—2014年2月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院通過腸鏡檢測為結(jié)腸息肉樣病變，大小均以大于或等于1.0 cm，排除結(jié)腸淋巴瘤后350例；分組：對照組：為200例查結(jié)腸鏡結(jié)腸粘膜正常患者，男性126例，女性74例，平均年齡（50±6.5）歲；實驗①組：電子結(jié)腸鏡下行息肉切除（EMR）或剝離（ESD）后病理學(xué)檢查證實230例單純結(jié)腸腺息肉患者,其中男性123例，女性107例，平均年齡（55±5.5）歲；實驗②組：電子結(jié)腸鏡下行息肉切除（EMR）或剝離（ESD）后病理學(xué)檢查證實結(jié)腸早癌120例患者，其中男性68例，女性52例，平均年齡（57±5.5）歲。

1.2 材料

電子結(jié)腸鏡(Olympus),細(xì)胞裂解液，Rb PTEN、PHLPP兔抗人一抗,羊抗兔二抗,5×上樣baffer,Ecl試劑盒 （以上試劑盒及抗體購自上?？婆d公司），電泳及電轉(zhuǎn)槽等western儀器設(shè)備（鄭州大學(xué)基礎(chǔ)實驗室）。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)鏡治療過程 結(jié)腸鏡下EMR或ESD操作見圖1。

圖1 一例直腸息肉內(nèi)鏡下粘膜剝離術(shù)：①術(shù)前鏡下觀；②NBI染色后；③完整粘膜剝離后；④剝離組織塊。

1.3.2 檢測指標(biāo) 三組患者，均檢測血清促炎因子 TNF-a、IL-6、COX2水平,抑炎因子IL-10水平，檢測組織APC、PTEN、PHLPP蛋白表達(dá)量。

1.3.3 蛋白印跡試驗 將收集各樣品在低溫下提取總蛋白,取上清液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定上清液蛋白濃度，樣品均以50ng總蛋白計算上樣液體量,進(jìn)行12.5%PAGE凝膠泳,行電泳、電轉(zhuǎn),使蛋白轉(zhuǎn)膜,將NC膜用封閉液封閉,再加入一抗低溫4℃過夜，加入二抗室溫孵育,將NC膜置于ECL(增強化學(xué)發(fā)光試劑)中反應(yīng)1～3 min,暗室中使X線片曝光,常規(guī)方法顯影定影,X線片上的條帶用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值，以：APC、PTEN、PHLPP/β-actin的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

以mean±SD數(shù)據(jù)處理并用SPSS 13.0分析,兩個獨立樣本資料采用有序多分類資料秩和檢驗（Wilcoxon），計量資料組與組之間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清炎癥因子結(jié)果分析顯示

（1）實驗①組與對照組IL-6、Cox2，抑炎因子IL-10水平血清濃度比較，無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。（2）實驗②血清 IL-6、Cox2濃度較實驗組①高，分別為（22.45±4.65）、（31.20±3.46）升高至（45.46±5.69）、（56.46±6.68），而明顯高于對照組（18.21±3.68）,（24.16±4.02）；血清抑炎因子IL-10則明顯下降，由實驗①組（33.46±3.89）下降至（16.56±2.68），較對照組（38.46±4.69）下降明顯,實驗②組血清IL-6、Cox2、IL-10 與對照組、實驗①組比較，P=0.0035、P=0.0040、P=0.0340；P=0.0045、P=0.0328、P=0.0409。3）血清 TNF-a 各實驗組與對照組均為差異，以及實驗組之間比較無差異 (表1)。

表1 實驗組與對照組血清TNF-a、IL-6、Cox2水平和抑炎因子IL-10的變化

2.2 Western-blot檢測抑癌因子水平表達(dá)

其中實驗①組組織APC、PTEN、PHLPP蛋白表達(dá)水平與對照組比較，均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），實驗②與對照組比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中PHLPP有顯著意義（P＜0.01）；實驗②組與實驗①組比較，均有統(tǒng)計學(xué)差異，且PHLPP存在顯著差異（P＜0.01）。（見表2）。

表2 Western-blot檢測APC、PTEN和PHLPP蛋白的表達(dá)

3 討論

我國大腸癌發(fā)病率逐年增高[4-5]，近30年我國大腸癌發(fā)病率總體增加了36.7%。而美國等西方國家，大腸癌發(fā)病率和死亡率逐步下降，原因是在預(yù)防方面如及時去除癌前病變及結(jié)腸早癌，并且建立了循證篩查、并推廣。大腸腫瘤篩查被列為國家“十一五”疾病防治工作重點課題[6]?，F(xiàn)已證實，85%結(jié)腸癌均由結(jié)腸息肉發(fā)展、惡變而形成，在這一演進(jìn)過程中，患者血清炎癥因子或組織抑癌基因濃度有無變化，尚無類似研究。本研究通過對比分析正常人、結(jié)腸腺息肉患者及結(jié)腸早癌患者血清炎癥因子檢測水平及組織中抑癌基因表達(dá)水平，得出炎癥因子在結(jié)腸腺息肉向結(jié)腸早癌的發(fā)生、發(fā)展的作用，初步探討及作用機制，并分析提示結(jié)腸早癌敏感抑癌基因，為臨床結(jié)腸早癌刷查血清敏感性指標(biāo)提供幫助，并為結(jié)腸癌治療效果評估指標(biāo)，這是本研究重點及臨床意義。

Paiotti AP等[7]證實,COX2在腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生中，起重要作用,活動性潰瘍性結(jié)腸炎患者表達(dá)明顯增強,表達(dá)越強，其腸道炎癥也越嚴(yán)重。本實驗證實，在結(jié)腸早癌組促炎因子IL-6、Cox2表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)腸組、結(jié)腸腺瘤組血清，P<0.05，而結(jié)腸腺瘤組與正常結(jié)腸組血清分析比較無差異。而抑癌因子IL-10則在結(jié)腸早癌組血清檢測最低，說明促炎因子IL-6、Cox2及抑炎因子IL-10在結(jié)腸腺息肉向結(jié)腸癌演變發(fā)展中可能起到一定作用，不排除參與結(jié)腸腺瘤向早癌的演進(jìn)。這與臨床理論相符，即結(jié)腸或息肉粘膜反復(fù)炎癥就容易癌變，但機制需進(jìn)一步研究。而TNF-α存在2個結(jié)構(gòu)不同的受體，傳導(dǎo)不同的傳導(dǎo)信號:1型和2型受體(TNFR1、TNFR2)，前者導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，后者是一種促炎因子,在本實驗中，TNF-α在正常結(jié)腸粘膜組、結(jié)腸腺瘤組及結(jié)腸早癌組血清表達(dá)水平均無明顯差異，說明TNF-α信號通路存在一種負(fù)反饋平衡,一方面，TNF-α作為促炎炎癥，可引起結(jié)腸腺瘤的發(fā)生、演進(jìn)；另一方面，增強TNF-α誘導(dǎo)不典型增生細(xì)胞凋亡[8]。

腸道抑癌基因據(jù)報道有：APC、PTEN、PHLPP,這些基因減少及失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展的分子水平基礎(chǔ)，但那個基因在組織檢測水平差異最大，或是哪個基因敏感性最高尚無相關(guān)研究。本實驗檢測到,在結(jié)腸早癌組織中，以上三種抑癌基因均表達(dá)減少，這與理論一致，以上基因低表達(dá)與Akt/mTOR通道調(diào)控有關(guān)[8]：①在85%結(jié)腸癌中APC基因缺失或失活，并且該基因的缺陷與結(jié)腸癌的遺傳易感性直接相關(guān)，在散發(fā)性大腸癌的發(fā)生中APC基因突變也起著重要作用[9]。APC蛋白失表達(dá)可能與大腸癌的發(fā)生及演進(jìn)密切相關(guān)。②PTEN調(diào)控Akt/mTOR通路去磷酸化調(diào)控VEGF發(fā)揮腫瘤抑制功能[10]，通過磷酸化而失活。③PHLPP參與調(diào)控Akt/mTOR通路中Akt的磷酸化及去磷酸化，也是腫瘤生長調(diào)節(jié)分子位點。總體來說，抑癌基因APC、PTEN、PHLPP在結(jié)腸早癌組織較正常結(jié)腸組織及結(jié)腸腺瘤組織中表達(dá)減低，統(tǒng)計分析存在差異，P<0.035、P<0.042。而PHLPP表達(dá)水平有顯著差異P<0.007，提示PHLPP是結(jié)腸早癌組織表達(dá)水平在三者中為最敏感指標(biāo)。為早期結(jié)腸癌篩查提供幫助，同時可通過檢測以上基因水平評估結(jié)腸癌藥物治療療效性。

本實驗?zāi)軌虻玫剑傺滓蜃覫L-6、Cox2與抑炎因子IL-10，在不同等級結(jié)腸粘膜病變血清檢測值不同，分析可能共同參與結(jié)腸腺息肉向結(jié)腸早癌的發(fā)生及演進(jìn)，并能通過對病人血清炎癥因子檢測提供預(yù)警信號；同時結(jié)腸組織中抑癌基因APC、PTEN、PHLPP表達(dá)水平，在結(jié)腸早癌組織中表達(dá)顯著減少，PHLPP表達(dá)更為敏感，為早期結(jié)腸癌篩查提供幫助，同時可通過檢測以上基因水平評估結(jié)腸癌藥物治療療效性。分析機制可能因Akt/mTOR通道調(diào)控調(diào)控以上抑癌基因，磷酸化失活失去對腫瘤發(fā)生及演進(jìn)的抑制作用有關(guān)。本研究為臨床結(jié)腸早癌篩查工作及結(jié)腸癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)提出了創(chuàng)新思維，并為大腸癌的防治作出指導(dǎo)性意義，同時下一步我們通過應(yīng)用Akt/mTOR通道抑制劑雷帕霉素前后檢測炎癥因子及抑癌基因表達(dá)水平，評估雷帕霉素在防治結(jié)腸癌臨床療效性。

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