遺傳性抗凝血酶缺陷癥基因突變的研究進(jìn)展

李正民，宮璀催*，方盼盼，徐立博

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 科研中心，河南 鄭州450052；2.中國人民解放軍第153中心醫(yī)院濟(jì)南軍區(qū)檢驗(yàn)中心;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生院)

人體的抗凝系統(tǒng)主要有抗凝血酶(antithrombin,AT)系統(tǒng)(包括抗凝血酶和肝素，主要抑制具有絲氨酸蛋白酶活性的凝血因子，如：FXa，凝血酶等)和蛋白C系統(tǒng)(包括蛋白C,蛋白S,血栓調(diào)節(jié)蛋白,內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體等，主要滅活凝血因子Ⅴ和Ⅷ等)，而抗凝血酶系統(tǒng)中的抗凝血酶是人體最重要的抗凝因子之一，約占抗凝活性的70%?？鼓甘且环N絲氨酸蛋白酶(serpins)抑制劑，主要具有抑制絲氨酸蛋白酶活性的凝血酶、FXa等因子，在人體抗凝系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。

1 抗凝血酶的分子生物學(xué)特性

抗凝血酶也稱為抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ),由Seegers,Johnson和Fell在1950年代進(jìn)行的早期科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，依次命名了四種AT(分別為ATⅠ、ATⅡ、ATⅢ、ATⅣ),但目前只發(fā)現(xiàn)ATⅢ有臨床意義，通常用AT代指ATⅢ。

AT是一種由肝細(xì)胞合成分泌的糖蛋白，分子量為58KD，屬于小分子蛋白。編碼AT蛋白的基因全長14206 bp( GenBank: X68793.1)，位于染色體1q23-25，共有7個(gè)外顯子(1、2、3a、3b、4、5、6)、6個(gè)內(nèi)含子。

AT的蛋白結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由464個(gè)氨基酸(aa)組成，有9個(gè)a螺旋、3個(gè)β折疊(包括A、B、C)和一個(gè)反應(yīng)中心環(huán)(RCL)，包含了3個(gè)二硫鍵和4種糖基化位點(diǎn)。三個(gè)單體內(nèi)的六個(gè)氨基酸形成二硫鍵：Cys8- Cys128,Cys21- Cys95,Cys248- Cys430。四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)位于人類抗凝血酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的96、135、155、192位置處的天冬酰胺氨基酸殘基。在血漿中發(fā)現(xiàn)的AT主要形式是α-AT，它的4個(gè)糖基化位點(diǎn)各由1個(gè)共價(jià)低聚糖所占據(jù)附著，導(dǎo)致這種形式的AT分子量達(dá)到58200；次要形式是β-AT(約占10%左右)，它的4個(gè)糖基化位點(diǎn)中保留1個(gè)未被占據(jù)的135位處天冬酰胺糖基化位點(diǎn),反應(yīng)中心環(huán)中的P14、P15在β折疊結(jié)構(gòu)A中展開的一種AT結(jié)構(gòu)，是凝血酶的主要抑制物，對FXa的抑制能力比a-AT增加了300多倍。

AT在血漿中的半衰期約為72 h,在正常人血漿中的濃度約為0.12 mg/ml，即約為2.3 uM?？鼓敢呀?jīng)被從人類以外的物種中分離取得，經(jīng)蛋白質(zhì)分析和cDNA測序結(jié)果顯示，牛、羊、兔和鼠的AT氨基酸鏈長度均為433個(gè)殘基，比人類AT多1個(gè)氨基酸殘基，這個(gè)額外的氨基酸殘基出現(xiàn)在第六位的氨基酸殘基位點(diǎn)上；牛、羊、兔、鼠與人類的AT基因序列相比，有84%-89%的一致性。

AT的主要功能是能夠滅活凝血酶，抑制Xa因子以及Ⅸa、Ⅻa因子蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶，從而發(fā)揮抗凝血作用[1]。其次，AT能與肝素結(jié)合，使抗凝作用增加數(shù)千倍以上。此外，AT還具有抗炎癥和抗血管新生的作用。有研究報(bào)道[2]:AT有兩個(gè)重要的功能區(qū)，一個(gè)是位于羧基(C)端的反應(yīng)位點(diǎn),AT的反應(yīng)位點(diǎn)在P1(Arg393)位和P1’(Ser394)位，P1通過與凝血酶活性中心的Ser結(jié)合，形成穩(wěn)定的AT-凝血酶復(fù)合物，而滅活凝血酶;另一個(gè)是位于氨基(N)端的肝素結(jié)合區(qū)。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)AT在血液中的濃度較低，此時(shí)AT的抗凝活性較小，但在有肝素分子存在的情況下，能夠與肝素中的戊糖(pentasaccharide)序列結(jié)合，AT的構(gòu)象發(fā)生改變，反應(yīng)中心環(huán)(RCL)暴露，能夠最有效的發(fā)揮抗凝作用[3]。

2 遺傳性抗凝血酶缺陷癥

遺傳性抗凝血酶缺陷癥是遺傳性易栓癥的一種，由Egeberg[4]于1965年首次報(bào)道，是由于編碼抗凝血酶的基因發(fā)生突變所引起的一種常染色體顯性遺傳病，在人群中的發(fā)病率為萬分之二到萬分之五，中國人在靜脈血栓栓塞癥中的發(fā)病率為5.75%-7.14%[5]。遺傳性抗凝血酶缺陷癥主要臨床表現(xiàn)為易反復(fù)形成靜脈血栓，如腸系膜靜脈、髂靜脈、下肢深靜脈等，最常見部位為下肢深靜脈血栓，有些情況下也可在肺部形成血栓導(dǎo)致肺栓塞；少數(shù)動(dòng)脈血栓可形成心肌梗死、甚至腦梗死。通常情況下，AT缺陷人群在AT基因發(fā)生突變的遺傳性因素作用下，發(fā)生靜脈血栓栓塞癥的風(fēng)險(xiǎn)比正常人群增加了數(shù)倍，但AT基因發(fā)生突變的人群不會(huì)完全都形成遺傳性AT缺陷癥，遺傳性AT缺陷癥的發(fā)生也同時(shí)受到獲得性誘因的影響，如手術(shù)、創(chuàng)傷、長時(shí)間制動(dòng)、高齡、惡性腫瘤、口服避孕藥、妊娠等，在遺傳性基因突變和獲得性誘因的雙重作用下，遺傳性AT缺陷癥的發(fā)生率將顯著增加。

遺傳性AT缺陷癥按照臨床分型，可分為兩型。Ⅰ型：是由于AT合成障礙，表現(xiàn)為AT含量的減少和AT活性的降低；Ⅱ型：是由于AT結(jié)構(gòu)的異常，僅表現(xiàn)為AT活性的降低。Ⅱ型又根據(jù)AT蛋白變異缺陷部位的不同，分為三種亞型：Ⅱa型(又稱ⅡRS型，反應(yīng)位點(diǎn)變異)，是在AT與凝血酶的作用位點(diǎn)發(fā)生變異；Ⅱb型(又稱ⅡHBS型，肝素結(jié)合位點(diǎn)變異)，是在AT與肝素的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變異；Ⅱc型(又稱ⅡPE型，多重變異)，為AT存在著多部位分子變異，呈多態(tài)性遺傳缺陷。

遺傳性AT缺陷癥存在著純合子突變和雜合子突變。AT純合子突變的患者常常在出生時(shí)即可發(fā)病，常表現(xiàn)為多部位的、反復(fù)的發(fā)生動(dòng)、靜脈血栓栓塞癥，甚至有時(shí)可危及患兒生命，存活率較低，需要長期使用抗凝藥物治療；雜合子突變的患者常在青少年期發(fā)病，有時(shí)在獲得性誘因的作用下發(fā)病年齡可提前至兒童期，此型發(fā)生的靜脈血栓栓塞癥比純合子型相對較輕，但因易反復(fù)發(fā)生，應(yīng)定期監(jiān)測凝血機(jī)制，可進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)防性用藥。

3 抗凝血酶的基因突變類型與功能

經(jīng)檢索相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及查閱人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)[6]，截止至2012年12月，已發(fā)現(xiàn)269種引起遺傳性抗凝血酶缺陷癥的基因突變，突變形式包括點(diǎn)突變(錯(cuò)義突變、無義突變)151種、剪切位點(diǎn)突變19種、缺失69種、插入26種、重組突變4種。AT是主要的內(nèi)源性抗凝血?jiǎng)?，這種蛋白的基因突變導(dǎo)致的分子功能障礙或缺陷，顯著增加了血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)突變的位置不同(調(diào)節(jié)區(qū)或編碼區(qū))、血栓形成部位的不同，導(dǎo)致的臨床癥狀有所不同，有些突變無明顯臨床癥狀，有些突變可形成特殊部位的血栓栓塞、出血等而危及生命。

3.1 點(diǎn)突變(錯(cuò)義突變、無義突變)

點(diǎn)突變(point mutation)是DNA多核苷酸鏈中單個(gè)堿基或堿基對的改變。在已知的AT基因突變中，點(diǎn)突變是最常見的突變形式，占已發(fā)現(xiàn)的AT基因突變的60%。點(diǎn)突變分為堿基替換和移碼突變，發(fā)現(xiàn)的AT點(diǎn)突變主要是堿基替換(堿基替換中報(bào)道最多的是無義突變和錯(cuò)義突變)。據(jù)L.Hougardy等報(bào)道[7]，在進(jìn)行肝移植的供體中，基因檢測證實(shí):供體的AT 2號(hào)外顯子基因存在g.2586 C>T(p.Pro41Leu)堿基替換；在隨后的遺傳試驗(yàn)中，確診為AT IIB型缺陷,是存在于AT肝素結(jié)合區(qū)的一個(gè)突變，導(dǎo)致AT與肝素的結(jié)合能力顯著下降，不能發(fā)揮有效的抗凝作用。另據(jù)Picard V等報(bào)道[8],AT的Phe299Leu突變，導(dǎo)致合成了一種不耐熱的復(fù)雜性AT蛋白，引起了AT功能缺陷。近年來，國內(nèi)的顧怡等[9]報(bào)道了在同一家系中發(fā)現(xiàn)AT基因第2號(hào)外顯子區(qū)存在兩處點(diǎn)突變(錯(cuò)義突變)，分別是c.134G>A和c.342T>G,分別導(dǎo)致編碼的AT蛋白Arg(CGG)被Gln(CAG)所替代(p.Arg13Gln)和Ser(AGT)被Arg(AGG)所取代(p.Ser82Arg)，這些突變分別導(dǎo)致了AT蛋白的表達(dá)障礙，分泌減少。

也有學(xué)者認(rèn)為AT基因點(diǎn)突變引起的AT缺陷癥，不完全是由于突變造成的蛋白表達(dá)異常，也存在著：AT蛋白能夠正常表達(dá)，但在肝細(xì)胞內(nèi)滯留，不能進(jìn)入血漿，胞內(nèi)濃度過高，形成AT生成的負(fù)反饋，從而造成分泌減少。Fitches AC等[10]報(bào)道了Ser82Asn引起的I型AT缺陷癥，在進(jìn)行深入表達(dá)研究后認(rèn)為第82位氨基酸糖基化阻礙了AT翻譯后的折疊、AT存在細(xì)胞內(nèi)滯留，導(dǎo)致肝細(xì)胞分泌AT減少。Tanaka Y[11]等報(bào)道了C95R突變，導(dǎo)致CYS21-95間二硫鍵丟失，AT以寡糖形式聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，AT分泌速度明顯減慢。

據(jù)研究證實(shí)SERPINC1(AT基因符號(hào))較低的突變(尤其是編碼區(qū))，對抗凝血酶表達(dá)水平的異質(zhì)性影響較小，Dela Morenabarrio ME[12]等報(bào)道了AT基因的調(diào)節(jié)區(qū)突變(Ag.2143C>G),這種突變對外顯子沒有影響，僅對啟動(dòng)子略有影響，但其仍可以轉(zhuǎn)錄。而有些突變，可危及生命，據(jù)Kumar R[13]等報(bào)道了一對患有先天性AT缺乏癥的新生兒兄妹(c.1009C>T;p.Q337X雜合突變)，發(fā)現(xiàn)存在有廣泛的小兒腦靜脈竇血栓形成(CSVT)以及腦實(shí)質(zhì)和腦室內(nèi)出血，危機(jī)患兒生命。

3.2 剪切位點(diǎn)突變

剪切位點(diǎn)突變是指酶切位點(diǎn)處的突變,該類突變發(fā)生率相對較少。Szymanska M等[14]報(bào)道了一種9788 G>A的剪切位點(diǎn)突變，在內(nèi)含子4的5，端剪切位點(diǎn)第1個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的雜合突變(IVS4+1G>A),使得內(nèi)含子4的剪切供體由G變?yōu)锳。該病人伴多發(fā)性靜脈血栓栓塞和缺血性中風(fēng)、短暫性腦缺血，該突變對靜脈血栓形成具有較高風(fēng)險(xiǎn)，這是首次對伴有復(fù)發(fā)性腦缺血的AT剪切位點(diǎn)突變的報(bào)道。

3.3 缺失和插入突變

缺失和插入突變是一種由于基因組DNA多核苷酸鏈中堿基對的插入或缺失，以致自插入或缺失點(diǎn)之后部分的或所有的三聯(lián)體遺傳密碼子組合發(fā)生改變的基因突變形式，亦統(tǒng)稱為移碼突變。此種突變直接的分子遺傳學(xué)效應(yīng)是導(dǎo)致其所編碼的蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸組成種類和順序的改變。目前，AT的7個(gè)外顯子均發(fā)現(xiàn)有缺失的相關(guān)報(bào)道，有些為單一部位的堿基對的缺失，也有多部位缺失的報(bào)道。據(jù)報(bào)道：法國的兩個(gè)家族中AT的外顯子3A上分別出現(xiàn)小移碼缺失，因此引起患者的AT基因缺乏翻譯，AT分泌減少，導(dǎo)致兩家族多成員發(fā)生血栓栓塞癥[15]。關(guān)于多部位的缺失，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)了AT基因組12個(gè)部位的缺失，這些缺失突變造成終止密碼子的形成，轉(zhuǎn)錄提前停止，從而影響AT肝素結(jié)合位點(diǎn)和反應(yīng)位點(diǎn)的形成，降低了AT活性[16]。

某些情況下，在DNA復(fù)制或損傷修復(fù)過程中，某一片段沒有被正常復(fù)制或未能得到修復(fù)，導(dǎo)致形成片段缺失突變。Picard等[17]對22例疑似遺傳性I型AT缺陷而基因測序結(jié)果無突變的患者，使用多重連接酶依賴性探針擴(kuò)增法(MLPA)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中10例為雜合子大片段缺失(5例為整個(gè)基因缺失；5例為部分缺失，包括外顯子6缺失2例，外顯子1-2缺失1例，外顯子5-7缺失2例)。韓國學(xué)者[18]報(bào)道了一位27歲的韓國男性患者，AT雜合大跨越外顯子1-6缺失，這種大片段缺失導(dǎo)致患者在17歲時(shí)左腿即出現(xiàn)紅腫熱痛等癥狀，18歲時(shí)發(fā)生了危及生命的肺栓塞、呼吸困難，后持續(xù)采用抗凝藥物治療。

3.4 重組突變

重組突變是指在生物體進(jìn)行有性生殖的過程中，控制不同性狀的基因重新組合的突變形式。近年來，AT的重組突變報(bào)道相對較少，但采用重組技術(shù)獲得的新類型、新功能的AT卻有不少報(bào)道。有報(bào)道[19]稱發(fā)現(xiàn)了一種新類型的R47C和P41L嵌合體重組突變，肝素結(jié)合位點(diǎn)不能顯露，導(dǎo)致抗凝血酶結(jié)合肝素能力缺陷。近年來，對于生產(chǎn)各種生物制劑的基因重組技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛，有報(bào)道[20]稱開發(fā)出了一種更安全的抗凝血酶變種，可作為肝素衍生物-磺達(dá)肝素鈉的解毒劑?；沁_(dá)肝素鈉是一種人工合成的五糖類肝素衍生物，具有強(qiáng)大的抗凝作用，可作為肝素的替代品使用，但需要長期連續(xù)監(jiān)測凝血機(jī)制，以免過量使用造成患者出血等不良反應(yīng)。這種AT的變種(AT-N135QPro394)有兩處突變,增加了對肝素及衍生物的親和力(對磺達(dá)肝素鈉的親和力增加了3倍)，取消了抗凝血活性，據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明其可以有效抑制磺達(dá)肝素鈉的作用，可以作為解毒劑使用。

4 小結(jié)

AT的基因突變可以導(dǎo)致AT蛋白的分泌障礙或使其在細(xì)胞內(nèi)滯留而不能發(fā)揮抗凝血作用，可使AT的反應(yīng)位點(diǎn)變異而降低抵抗凝血酶的活性，可使肝素結(jié)合位點(diǎn)變異而降低與肝素親和力。作者查閱近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)遺傳性抗凝血酶缺陷癥的基因突變多為點(diǎn)突變；引起I型抗凝血酶缺陷癥的基因突變大多為不同位點(diǎn)突變，引起II型抗凝血酶缺陷癥的基因突變大多為重復(fù)位點(diǎn)突變；抗凝血酶缺陷癥的基因突變大多數(shù)為雜合突變，報(bào)道的純合子突變均為II型抗凝血酶缺陷癥，病死率較高。在做AT基因突變研究時(shí)，也應(yīng)注意基因多態(tài)性問題，可以查閱人類單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫，或應(yīng)至少檢測100份以上正常人的同一基因突變位點(diǎn)以排除基因突變的多態(tài)性。近年來，對于易栓癥的綜述報(bào)道較多，但對于遺傳性AT缺陷癥的綜述報(bào)道較少，特別是對于AT基因突變的綜述少有報(bào)道，本文對遺傳性AT缺陷癥的基因突變研究進(jìn)展做一綜述，對于以后的AT基因突變研究有一定的幫助作用。

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