損傷性ED動物模型研究進展

崔志強宋魯杰綜述 盧洪凱王永傳審校

1. 山東省濰坊市中醫(yī)院泌尿外科（濰坊 261041）;

2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科; 3.濰坊市人民醫(yī)院泌尿外科

·綜 述·

損傷性ED動物模型研究進展

崔志強1宋魯杰2綜述 盧洪凱3王永傳1審校

1. 山東省濰坊市中醫(yī)院泌尿外科（濰坊 261041）;

2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科; 3.濰坊市人民醫(yī)院泌尿外科

近年來，前列腺根治術(shù)（RP）和根治性膀胱切除術(shù)、外傷所致的骨盆骨折和尿道斷裂（pelvic fracture urethral disruption, PFUD）以及骨盆和后尿道手術(shù)的患者不斷增多，其可對CN產(chǎn)生不同方式及程度的損傷，ED作為它們并發(fā)之一，發(fā)病率也不斷增加，國外文獻報道保留單側(cè)和雙側(cè)神經(jīng)血管束（NVB）的RP后ED發(fā)病率分別為76%和53%[1]，PFUD患者ED發(fā)生率高達42%[2]，后尿道端端吻合術(shù)后ED的發(fā)生率為56%[3]。ED可對男性及其配偶的身體和心理健康產(chǎn)生重要的影響[4]，為此，許多科學(xué)家參與了對ED的研究。1863年，Eckhard[5]首次報道了盆腔神經(jīng)在勃起功能中的重要性，提出了ED的基本概念，并增加了我們對ED病理生理學(xué)的認(rèn)識[6]。通過對調(diào)節(jié)勃起的神經(jīng)生理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)許多激素和神經(jīng)遞質(zhì)對陰莖勃起起到重要作用[7]。雖然人類性功能復(fù)雜的屬性不可能被完全復(fù)制，但是動物模型是研究和評估ED的重要方式?，F(xiàn)將損傷性ED動物模型的相關(guān)研究進展綜述如下。

一、動物的選擇

雖然狗、猴子、貓和兔子等大動物在早期（1960-1990）常被作為研究勃起功能的模型，但是嚙齒類動物已在很大程度上取代這些大的動物作為主要的動物模型，主要有以下幾個原因：第一是實驗費用方面，嚙齒類動物比大動物更經(jīng)濟；第二是嚙齒類動物模型已被充分證明具有和人類相似的形態(tài)和功能；第三是手術(shù)操作和CN解剖方面，嚙齒動物模型很更簡單、容易；第四是由于嚙齒類動物壽命較短，在此期間內(nèi)，可以通過檢測動物的生物反應(yīng)評估疾病狀態(tài)和治療性干預(yù)的效果[8]。雖然嚙齒類動物模型在ED研究中有許多優(yōu)點，但是它不能代表人類復(fù)雜的性行為和疾病。因為嚙齒類動物的壽命比較短，所以不允許長期研究不同ED模型類型。雄性大鼠的性反應(yīng)主要依賴于嗅覺刺激，而人類更多地依賴于視覺和聽覺刺激。此外，嚙齒類動物不能完全理解陰莖勃起反應(yīng)的含義，電刺激和成功插入雌性大鼠陰道分別引起的陰莖勃起也是有所不同的，而事實上，嚙齒類動物通過交配和電刺激引起的勃起反應(yīng)與人類的也是有區(qū)別的。盡管如此，嚙齒類動物模型對人類仍具有較高的可預(yù)測性。鑒于上述種種原因，嚙齒類動物目前被作為ED研究的最常用的動物模型。

二、勃起反應(yīng)的評價方法

海綿體內(nèi)壓（ICP）檢測是陰莖勃起研究的重要方法，電刺激麻醉狀態(tài)大鼠的周圍神經(jīng)，并測量其ICP的變化。阿樸嗎啡（APO）具有誘發(fā)勃起的藥理作用，雄性大鼠注射APO后可引起陰莖勃起反應(yīng)[9]。Quinlan等[10]對CN損傷動物模型進一步研究后提出，通過測量ICP和平均動脈壓（MAP）的變化來檢測CN損傷對勃起反應(yīng)的影響。動態(tài)海綿體造影和陰莖海綿體測壓提供了海綿體平滑肌功能評價的指標(biāo)[11]。電刺激或化學(xué)刺激特定的大腦區(qū)域也可以引起陰莖勃起，內(nèi)側(cè)視前區(qū)和下丘腦室旁為研究調(diào)節(jié)陰莖勃起行為的中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供了更高級的神經(jīng)中心?？诜⑵は?、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)和海綿體等不同的給藥途徑已被用于研究它們對陰莖勃起的影響。

隨著蛋白質(zhì)標(biāo)記、免疫組化和Western blot分析等先進技術(shù)的發(fā)展，改進了對ED功能和形態(tài)學(xué)的評估，并增加了對ED病理生理學(xué)的理解[11-13]。動物模型和人類的海綿體組織通過原代細(xì)胞培養(yǎng)，可以增加我們對勃起功能細(xì)胞機制的了解[14]。在體外實驗中，利用重組載體敲除（KO）蛋白質(zhì)或酶，以及利用間充質(zhì)干細(xì)胞進行自體細(xì)胞培養(yǎng)，也增加對病理生理學(xué)的認(rèn)識[15]。

三、損傷模型的分類

（一）CN損傷模型

Walsh和Donker[16]首次報道了骨盆手術(shù)對勃起神經(jīng)通路的影響，前列腺癌根治術(shù)（RP）可以導(dǎo)致ED。有研究表明，RP后性功能恢復(fù)情況與術(shù)前有效的保護神經(jīng)血管束有密切的聯(lián)系，盡管技術(shù)不斷的創(chuàng)新和進步，但是CN在保留神經(jīng)（NS）的RP中仍然不可避免的被暴露和損傷，并導(dǎo)致ED。由于這個原因，許多科學(xué)家已經(jīng)建立了多種CN損傷的動物模型，每種CN損傷模型都有其優(yōu)點和缺點，實際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)需要選擇。

CN損傷模型的類型 Quinlan等[10]第一次利用嚙齒類動物模型研究陰莖勃起，利用電刺激誘導(dǎo)并測量大鼠的最大ICP，并建立了CN損傷模型的各種技術(shù)[17]。牽拉、擠壓、切斷、冷凍和切除CN等不同CN損傷方式已在各種動物模型中被廣泛應(yīng)用[18]。

CN擠壓模型可由止血鉗、動脈夾等外科器械引起，造成CN機械壓迫，擠壓時間為15s～2min[19,20]。在CN擠壓模型中，利用止血鉗擠壓CN 2min，發(fā)現(xiàn)ICP降低，盆大神經(jīng)節(jié)（MPG）和CN中的神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）陽性神經(jīng)纖維的含量顯著減少[19]；Sezen等[20]在CN損傷研究中也發(fā)現(xiàn)了ICP降低和陰莖背神經(jīng)中nNOS陽性神經(jīng)纖維的含量減少。

冷凍是另一種CN損傷方式，利用干冰冷凍損傷CN，早期出現(xiàn)ICP降低和nNOS陽性神經(jīng)纖維的含量減少，但是3個月后陰莖血流動力學(xué)和組織學(xué)恢復(fù)正常[21]。由于CN冷凍損傷保持相對完好的CN鞘，它在損傷的CN兩端提供了一個潛在的神經(jīng)軸突再生的神經(jīng)通路，從而恢復(fù)勃起功能。

游離性CN損傷的動物模型，從MPG到前列腺尖部游離CN，此過程中沒有CN擠壓和切斷，雖然早期發(fā)現(xiàn)ICP和nNOS陽性神經(jīng)纖維的含量減少，但是8周后它們明顯恢復(fù)[22]，這種動物模型為我們解釋了CN游離導(dǎo)致CN損傷性ED的機制。

最近，朱建強等[23]在電凝損傷CN動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，ICP/MAP下降，陰莖背神經(jīng)中神經(jīng)絲蛋白的含量減少，并且海綿體組織纖維化，術(shù)后第1周電刺激CN后陰莖無勃起反應(yīng)，ICP處于基線水平，雖然4周后ICP有了一定程度的提高，但仍顯著低于對照組。電凝損傷可以產(chǎn)生局部高溫，造成蛋白質(zhì)變性、組織缺血及炎癥反應(yīng)，對CN產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致ED。

CN切斷和切除是比較嚴(yán)重的CN損傷模型，CN切斷損傷使用剪刀直接切斷CN[24]，而CN切除損傷需要切除一段CN[25]，從理論上講，CN切除比CN切斷對勃起功能的影響更嚴(yán)重。CN鞘連續(xù)性中斷，缺乏神經(jīng)再生軸突到達靶組織的神經(jīng)通路，并導(dǎo)致不可逆的損害。此外，CN鞘損傷還可以導(dǎo)致陰莖平滑肌細(xì)胞凋亡，并引起靜脈閉塞性陰莖勃起功能障礙。

1. 單側(cè)CN損傷：Carrier等[26]發(fā)現(xiàn)單側(cè)CN損傷與雙側(cè)CN損傷相比，6個月后前者nNOS陽性神經(jīng)纖維的含量更多，ICP數(shù)值更高，勃起反應(yīng)更好。連續(xù)的神經(jīng)纖維可以合成神經(jīng)營養(yǎng)因子，并維持其支配器官的結(jié)構(gòu)和功能[27]，在CN擠壓和CN冷凍動物模型中也發(fā)現(xiàn)CN損傷后軸突再生的現(xiàn)象[20,21]。然而，單側(cè)CN切斷模型中對側(cè)CN未損傷，可能會對損傷側(cè)神經(jīng)的再生和恢復(fù)產(chǎn)生影響，并混淆實驗結(jié)果。

2. 雙側(cè)CN損傷：相比之下，雙側(cè)CN切斷后陰莖勃起功能迅速喪失，并且在整個實驗期間勃起功能完全喪失[10]。Zhang等[28]在雙側(cè)CN損傷模型中發(fā)現(xiàn)，nNOS陽性神經(jīng)纖維的含量在第3周時顯著減少，6月后神經(jīng)仍未出現(xiàn)再生。CN切斷2周后海綿體平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的組織學(xué)表現(xiàn)是顯而易見的[29]，可能是由于調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞凋亡的sonic hedgehog（SHH）減少造成的[30]。SHH被抑制之后陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞凋亡增加12倍，SHH治療CN損傷的動物模型后，海綿體平滑肌未出現(xiàn)明顯損傷性變化。因此，CN切斷引起的ED，可能是由于神經(jīng)破壞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌功能障礙造成的。

Jin等[31]在CN損傷導(dǎo)致ED的動物模型中，進一步說明了陰莖血流動力學(xué)紊亂和海綿體超微結(jié)構(gòu)改變，與對照組比較，ICP明顯降低，纖維化因子表達增強，凋亡細(xì)胞和磷酸化Smad2陽性的海綿體內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞數(shù)目增加，CN擠壓造成勃起反應(yīng)持續(xù)4W減弱，CN切斷引起的ED持續(xù)12W。

3. 轉(zhuǎn)基因CN損傷模型：NOS和一氧化氮（NO）在陰莖勃起過程中起到重要作用。目前，研究發(fā)現(xiàn)NO是激活NOS的重要因素，nNOS和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）具有重要作用。有研究認(rèn)為nNOS通過激活中樞和外周系統(tǒng)，在勃起反應(yīng)的起始階段起到重要作用，而eNOS促進血液流入海綿體竇，引起陰莖勃起[32]。基因工程小鼠缺乏nNOS和eNOS，ICP明顯降低，西地那非對nNOS基因KO小鼠增加勃起反應(yīng)的作用減弱[33]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)自然勃起數(shù)目增加，并且膠原蛋白和彈性蛋白的表達也增加[34]。TNF-α是一個促炎細(xì)胞因子，可以抑制eNOS表達，TNF-α基因KO小鼠的eNOS表達增強，有利于陰莖勃起。

最近研究認(rèn)為，iNOS具有防止組織纖維化和平滑肌細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性防御機制。Ferrini等[35]發(fā)現(xiàn)iNOS可以降低體內(nèi)組織的纖維化，并維持NO的藥理學(xué)水平。在iNOS基因KO小鼠中，體內(nèi)海綿體平滑肌/膠原的比例和平滑肌含量減少，這與ED動物模型中的結(jié)果一致。

（二）動脈結(jié)扎模型

陰莖動脈供血不足已被證明是ED的常見原因。髂內(nèi)-陰部內(nèi)-陰莖海綿體動脈系的動脈粥樣硬化或創(chuàng)傷性動脈閉塞性疾病可以導(dǎo)致陰莖血流灌注壓降低，改變陰莖血流動力學(xué)，導(dǎo)致ED的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，ED的出現(xiàn)早于冠心病[36]。結(jié)扎大鼠雙側(cè)髂內(nèi)動脈可以直接引起ICP降低，但1個月后勃起明顯恢復(fù)[37]。免疫組化染色顯示陰莖背神經(jīng)和海綿體神經(jīng)中nNOS陽性神經(jīng)纖維的含量減少，而聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）提示初期的TGFβ-1表達上調(diào)。與其他器官缺血性變化一樣，也會出現(xiàn)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞損傷、脂肪變性、膠原沉積和血竇塌陷等典型變化[38]。de Young等[39]也有類似的報道，海綿體組織中蛋白質(zhì)表達和血管內(nèi)皮的完整性發(fā)生改變，平滑肌纖維和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達減少，CN中nNOS陽性神經(jīng)纖維的含量也顯著減少。

急性夾閉單側(cè)陰部內(nèi)動脈或陰莖動脈可引起對側(cè)陰部內(nèi)動脈血流代償性增加，只影響同側(cè)ICP，但雙側(cè)夾閉陰部內(nèi)動脈引起雙側(cè)ICP顯著降低，嚴(yán)重影響勃起反應(yīng)[40]。然而慢性陰部內(nèi)動脈流入障礙對勃起功能影響較小，可能是由于陰莖周圍側(cè)枝循環(huán)建立緩解了這種缺血的改變。結(jié)扎髂內(nèi)動脈后海綿體內(nèi)注射VEGF，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)肥大和增生，血管生成作用顯著增強，可以促進勃起功能的恢復(fù)[41]。

（三）脊髓損傷模型

與CN損傷模型相比，脊髓損傷（SCI）和其他神經(jīng)系統(tǒng)損傷的ED動物模型報道比較少。Allard和Edmunds等[42]在SCI動物模型中發(fā)現(xiàn)，可以出現(xiàn)類似射精節(jié)律性的球海綿體肌和陰莖勃起收縮。脊髓橫斷比未受損傷脊髓的勃起反應(yīng)更強，并且肌電圖檢測發(fā)現(xiàn)球海綿體肌反射增強。Temeltas等[43]和Rivas等[44]在SCI模型中也發(fā)現(xiàn)了ICP的顯著增高。

四、結(jié)語

各種動物模型的開發(fā)和建立已在ED領(lǐng)域取得顯著進步。通過對勃起生理和再生醫(yī)學(xué)的研究，使我們對人類勃起功能障礙有了深刻的了解，也增加了對導(dǎo)致ED的病理生理學(xué)的理解，并可用于探索和測試新的治療ED的藥物和手術(shù)方式的效果。

雖然使用嚙齒類動物模型研究ED仍將是較為理想的動物模型選擇，但是我們需要認(rèn)識到，嚙齒類動物的年齡、種類和品系可能會影響和干擾藥物的作用，從而對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。開發(fā)更加符合人類病理生理學(xué)的損傷性ED動物模型將成為推動ED治療研究的重要工具。

致謝：本課題受國家自然科學(xué)基金資助項目（30901489）; 山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃資助項目（2011GGH21813）

模型,動物; 勃起功能障礙

1 劉繼紅, 詹鷹, 王濤. 臨床泌尿外科雜志 2008; 23(6): 405-408

2 Metze M, Tiemann AH, Josten C.J Trauma2007; 63(2): 394-401

3 Carlton J, Patel M, Morey AF.Asian J Androl2008; 10(1): 75-78

4 Lue TF, Giuliano F, Montorsi F,et al. J Sex Med2004; 1(1): 6-23

5 Eckhard C.Beitr Anat Physiol1863; 3: 123-126

6 Burnett AL.Int J Impot Res2001; 13(3): 135-139

7 Jin L, Burnett AL.Clin Sci (Lond)2006; 110(2): 153-165

8 Chung E, De Young L, Brock GB.J Sex Med2011; 8(12): 3291-3305

9 Heaton JP, Varrin SJ, Morales A.J Urol1991; 145(5): 1099-1102

10 Quinlan DM, Nelson RJ, Partin AW,et al. J Urol1989; 141(3): 656-661

11 Davila HH, Rajfer J, Gonzalez-Cadavid NF.Urology2004; 64(6): 1261-1266

12 Mehta N, Sikka S, Rajasekaran M.J Sex Med2008; 5(6): 1278-1283

13 Liu X, Gao X, Pang J,et al. BJU Int2007; 99(6): 1500-1505

14 Pilatz A, Schultheiss D, Gabouev AI,et al. Eur Urol2005; 47(5): 710-718; discussion 718-719

15 Melman A, Davies KP.Scientif cWorldJournal2009; 9: 846-854

16 Walsh PC, Donker PJ.J Urol1982; 128(3): 492-497

17 Martinez-Pineiro L, Brock G, Trigo-Rocha F,et al. Eur Urol1994; 25(1): 62-70

18 Canguven O, Burnett A.J Sex Med2008; 5(8): 1776-1785

19 Hsieh PS, Bochinski DJ, Lin GT,et al. BJU Int2003; 92(4): 470-475

20 Sezen SF, Blackshaw S, Steiner JP,et al. Int J Impot Res2002; 14(6): 506-512

21 El-Sakka AI, Hassan MU, Selph C,et al. J Urol1998; 160(6 Pt 1): 2245-2252

22 Yamashita S, Kato R, Kobayashi K,et al. Int J Urol2009; 16(11): 905-911

23 朱建強,王永傳,王梅利. 中華實驗外科雜志 2013;30(9): 1929

24 Mullerad M, Donohue JF, Li PS,et al. J Sex Med2006; 3(1): 77-83

25 Burnett AL, Becker RE.J Urol2004; 171(1): 495-500

26 Carrier S, Zvara P, Nunes L,et al. J Urol1995; 153(5): 1722-1727

27 User HM, Hairston JH, Zelner DJ,et al. J Urol2003; 169(3): 1175-1179

28 Zhang XH, Hu LQ, Zheng XM,et al. Asian J Androl1999; 1(3): 135-138

29 Lysiak JJ, Yang SK, Klausner AP,et al. J Urol2008; 179(2): 779-785

30 Podlasek CA.J Sex Med2009; 6 Suppl 3: 334-339

31 Jin HR, Chung YG, Kim WJ,et al. J Sex Med2010; 7(10): 3351-3364

32 Goldstein AM, Meehan JP, Morrow JW,et al. Br J Urol1985; 57(5): 574-578

33 Cashen DE, MacIntyre DE, Martin WJ.Br J Pharmacol2002; 136(5): 693-700

34 Carneiro FS, Sturgis LC, Giachini FR,et al. J Sex Med2009; 6(1): 115-125

35 Ferrini MG, Rivera S, Moon J,et al. J Sex Med2010; 7(9): 3033-3044

36 Montorsi P, Ravagnani PM, Galli S,et al. Am J Cardiol2005; 96(12B): 19M-23M

37 El-Sakka A, Yen TS, Lin CS,et al. Int J Impot Res2001; 13(3): 162-171

38 Anvar MD, Khiabani HZ, Nesland JM,et al. Eur J Vasc Endovasc Surg2000; 20(2): 125-131

39 de Young L, Bella A, Howard J,et al. J Sex Med2005; 2(2): 199-206

40 Aboseif SR, Breza J, Orvis BR,et al. J Urol1989; 141(2): 398-402

41 Lee MC, El-Sakka AI, Graziottin TM,et al. J Urol2002; 167(2 Pt 1): 761-767

42 Allard J, Edmunds NJ.Neuroscience2008; 155(1): 283-290

43 Temeltas G, Dagci T, Evren V,et al. J Sex Med2009; 6(12): 3265-3273

44 Rivas DA, Chancellor MB, Huang B,et al. J Spinal Cord Med1995; 18(4): 245-250

（2013-11-18收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.019

R 698.1