長沙青皮竹葉中黃酮類化合物的提取工藝條件

賈可敬，李湘洲，殷 凱

(中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

竹葉中的黃酮類化合物具有抑制脂質(zhì)過氧化、抗菌[1]、免疫調(diào)節(jié)[2-3]、保護(hù)心腦血管[4]、降血脂[5]、保護(hù)肝臟[6]和清除自由基等功能[7-9]。隨著人類對(duì)自身保健和養(yǎng)生方面的關(guān)注度越來越高，以天然黃酮為主打或者作為添加劑的產(chǎn)品將會(huì)倍受人們的青睞。

長沙青皮竹Bambusa textilisvar.persistens.B.M.Yang是一種生長在湖南長沙的青皮竹變種[10]，目前對(duì)其的研究報(bào)道僅限于作為觀賞竹種的植物學(xué)分類方面，其他方面的研究報(bào)道卻極少，而有關(guān)竹葉提取物的研究卻已成為當(dāng)今熱門的相關(guān)研究領(lǐng)域。因此，對(duì)長沙青皮竹葉提取物中活性成分的研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，黃酮或竹葉黃酮的提取方法有水提法、醇提法、微波輔助提取、超聲輔助提取、酶法、超臨界萃取和其他新方法[11-19]。為了給長沙青皮竹葉中黃酮類化合物的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)，文中采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，就乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間和固液比例等提取工藝條件對(duì)黃酮得率的影響情況進(jìn)行了試驗(yàn)研究，并采用紫外分光光度法對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行了量化分析，以期為長沙青皮竹的加工利用提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的長沙青皮竹、毛竹、假毛竹、斑竹、水竹和琴絲竹葉均于2012年10月采自中南林業(yè)科技大學(xué)竹園，經(jīng)晾干、粉碎，過60目篩，密封以備用。對(duì)照品蘆丁購自湖南省食品藥品鑒定研究院。

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95％乙醇、石油醚(30～60℃)等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

721N型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；AUY220型電子分析天平，日本島津；HH-S1s型恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照文獻(xiàn)[20]中的方法并稍加改進(jìn)，取10.8mg的蘆丁溶于100mL的30％乙醇溶液中，得到質(zhì)量濃度為108mg?L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液置于6個(gè)25mL的容量瓶中，用30％的乙醇溶液稀釋至8mL；加入濃度為50g?L-1的NaNO2溶液1mL，靜置6min，再加入濃度為100g?L-1的Al(NO3)3溶液1mL，靜置6min后再加入40g?L-1的NaOH溶液10mL，最后用30％的乙醇溶液定容，靜置10min，在510nm波長處測(cè)定吸光度。得到如下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)方程：

式中：A為吸光度，C為質(zhì)量濃度(mg?L-1)；R2為0.999 9。蘆丁乙醇溶液在0.00～34.56mg?L-1的范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好。

1.3.2 單因素試驗(yàn)方法

采用乙醇為提取劑，以竹葉黃酮得率為指標(biāo)，考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、固液比例和提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響情況。提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，以石油醚多次萃取葉綠素至石油醚無色，取下層液定容。移取一定體積溶液，按照“1.3.1”中說明的方法測(cè)定黃酮濃度，計(jì)算黃酮得率。各因素平行試驗(yàn)5次，取其平均值。

1.3.3 黃酮濃度及得率的計(jì)算

黃酮濃度的計(jì)算公式為：

黃酮提取率的計(jì)算公式為：

式(1)中：A為吸光度，C表示黃酮的質(zhì)量濃度(mg?L-1)。式(2)中：C亦為黃酮的質(zhì)量濃度(mg?L-1)，M竹葉為竹葉的質(zhì)量(mg)，V總為粗提液的定容體積，V取為移取用于測(cè)定黃酮濃度的粗提液的體積，0.025表示25mL容量瓶的體積(單位為L)。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)和固液比(D)作為試驗(yàn)因素，按照如表1的四因素三水平的正交試驗(yàn)方案進(jìn)行長沙青皮竹葉黃酮提取工藝的優(yōu)化試驗(yàn)。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS v19.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以確定最佳提取工藝。

表1 試驗(yàn)因素與試驗(yàn)水平Table 1 Test factors and levels

1.3.5 6種竹葉中黃酮含量的比較分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，采用優(yōu)化工藝，對(duì)長沙青皮竹、毛竹、假毛竹、斑竹、水竹和琴絲竹這6種竹竹葉中的黃酮類化合物進(jìn)行提取，測(cè)定其中的黃酮濃度，計(jì)算并比較竹葉中的黃酮含量，每種竹葉平行測(cè)定5次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響結(jié)果見表2。由表2可知，黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而逐漸增大。當(dāng)乙醇濃度為70％時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值；但當(dāng)乙醇濃度再增大時(shí)，黃酮類化合物的提取率反而減小。其原因可能是，乙醇溶液濃度低時(shí)，竹葉中醇溶性黃酮分子未被充分提取，故隨著乙醇濃度增加所得黃酮得率上升。

2.1.2 料液比對(duì)黃酮得率的影響

料液比對(duì)黃酮得率的影響結(jié)果見表3。當(dāng)料液比較低時(shí)，物料內(nèi)的黃酮無法被溶劑完全提取，而料液比較高時(shí)，雜質(zhì)含量也會(huì)提高，提取劑又不能得到最有效的利用，所以選擇適當(dāng)?shù)牧弦罕葘?duì)節(jié)約資源具有重要意義。由表3可知，當(dāng)料液比為35∶1時(shí)，黃酮得率最大(1.76％)；繼續(xù)增大料液比，黃酮得率卻不再繼續(xù)增加。

表2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響(n＝5)Table 2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids(n=5) ％

表3 料液比對(duì)黃酮提取率的影響(n＝5)Table 3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids(n=5) ％

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響

提取次數(shù)對(duì)黃酮得率的影響結(jié)果見表4。在溶液中提取黃酮時(shí)，有時(shí)需要兩次或多次提取才能達(dá)到較好的提取效果。由表4可知，提取3次和提取2次的黃酮得率基本不變，說明提取2次時(shí)已經(jīng)達(dá)到較好的效果了。這是由于提取1次時(shí)，黃酮分子在提取液中基本達(dá)到飽和，此時(shí)物料與溶液中的黃酮分子達(dá)到擴(kuò)散平衡，物料中的剩余黃酮分子無法被提取完全，故需要提取2次甚至多次。

表4 提取次數(shù)對(duì)黃酮提取率的影響(n＝5)Table 4 Effect of extraction times on extraction rate of flavonoids(n=5)

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

若提取時(shí)間不夠，則黃酮可能未被完全浸出。提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響結(jié)果見表5。由表5可知，提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響不大。當(dāng)提取時(shí)間為1.5h時(shí)，提取率為1.54％；繼續(xù)延長提取時(shí)間，黃酮得率略有下降；但總體結(jié)果顯示，提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響不明顯。其原因可能是，當(dāng)固液比較大時(shí)，固液接觸面的黃酮濃度差大，根據(jù)擴(kuò)散原理，黃酮分子擴(kuò)散的推動(dòng)力大，擴(kuò)散速率快，提取時(shí)間則縮短。

表5 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響(n＝5)Table 5 Effect of extracting time on extraction rate of flavonoids(n=5)

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表6為正交試驗(yàn)結(jié)果。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果?Table 6 Result of the orthogonal test

從表6中的極差分析結(jié)果可以看出：各因素對(duì)黃酮提取率的影響有差異，因素A對(duì)總黃酮提取率的影響最大，其次為因素C，因素B和D的影響程度基本相同。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。

從表7的方差分析結(jié)果中可以看出，在影響竹葉黃酮提取率的各因素中，因素A具有顯著性(F＞F0.05)，因素B、C和D無顯著意義(F＜F0.05)。綜合考慮單因素的試驗(yàn)效果、方差分析的顯著性水平與實(shí)際生產(chǎn)時(shí)的能源優(yōu)化，可以得出，提取長沙青皮竹葉中黃酮的最優(yōu)工藝條件組合為A3B2C1D1，即70％乙醇，按1∶25(g∶mL)的固液比提取3次，每次提取時(shí)間為1.5h。在此工藝條件下，平行試驗(yàn)5次，長沙青皮竹葉黃酮的得率為1.85％。

表7 方差分析結(jié)果?Table 7 Result of variance analysis

2.3 6種竹葉中黃酮含量的比較分析

根據(jù)正交優(yōu)化結(jié)果，采用優(yōu)化了的工藝條件，對(duì)長沙青皮竹、毛竹、假毛竹、斑竹、水竹和琴絲竹6種竹竹葉中的黃酮類化合物進(jìn)行了提取，并測(cè)定了所得黃酮的濃度，計(jì)算了竹葉中的黃酮含量，并進(jìn)行了比較分析。每種竹葉平行測(cè)定5次，取其平均值，測(cè)定結(jié)果見表8。由表8可知，在該工藝條件下所得長沙青皮竹葉的黃酮含量比其他5種竹葉中的黃酮含量要高，說明長沙青皮竹是一種可用以開發(fā)竹葉黃酮類產(chǎn)品的潛在原材料。

表8 6種竹葉中的黃酮含量(n＝5)Table 8 Flavonoids content in leaves of six bamboo species(n=5)

3 結(jié) 論

文中以黃酮得率為考察指標(biāo)，通過考察乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間和固液比例等因素對(duì)黃酮得率的影響情況，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)，最后得到的最佳提取工藝條件為：乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70％，固液比為1∶25，提取3次，每次提取時(shí)間為1.5h，在此條件下黃酮的得率為1.85％。各因素對(duì)提取率的影響程度的大小順序?yàn)椋阂掖紳舛龋咎崛〈螖?shù)＞提取時(shí)間≈固液比例。

在上述最佳提取工藝條件下，對(duì)6種竹葉中的黃酮進(jìn)行了提取，測(cè)定了其黃酮含量。結(jié)果顯示，6種竹葉中的黃酮含量為9.1～18.5mg?g-1。長沙青皮竹竹葉的黃酮含量比同時(shí)間同地點(diǎn)采摘的毛竹、假毛竹、斑竹、琴絲竹和水竹都要高，比文獻(xiàn)[21]中報(bào)道的其他竹葉的黃酮含量也要高，說明長沙青皮竹葉作為竹葉黃酮的生產(chǎn)原料具有一定的開發(fā)價(jià)值。

本試驗(yàn)采用硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法，利用紫外分光廣度法在510nm處測(cè)定吸光度以確定黃酮含量，其含量與用高效液相色譜法測(cè)定的結(jié)果具有一定的偏差[22]，偏差主要來自非黃酮類物質(zhì)的顯色，但對(duì)于酚酸類含量較少的竹葉提取物來說，也不失為一種簡單、快捷的黃酮含量的測(cè)定方法，這種測(cè)定方法適用于工業(yè)生產(chǎn)之中[23]。

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