刺五加過(guò)氧化氫酶基因的克隆與表達(dá)分析

邢朝斌，劉 巖，修樂(lè)山，龍?jiān)录t，吳 鵬

(河北聯(lián)合大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063000)

植物細(xì)胞正常代謝過(guò)程中，氧分子作為重要的電子受體，在傳遞電子時(shí)，通常還伴隨著部分電子逃逸出氧化還原系統(tǒng)，產(chǎn)生氧化能力極強(qiáng)、具有毒害作用的H2O2[1]。同時(shí)，植物在遭受病原菌脅迫及逆境脅迫時(shí)也可產(chǎn)生大量H2O2[2]。H2O2的過(guò)量積累可導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，抑制卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，從而對(duì)細(xì)胞造成較大的傷害，另外H2O2還可以直接作為氧化劑對(duì)植物組織產(chǎn)生毒害作用[3]。過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)廣泛存在于動(dòng)植物中，對(duì)于H2O2具有較高親和力，可有效地清除線粒體電子傳遞、脂肪酸氧化等過(guò)程中產(chǎn)生的H2O2，參與植物的多種脅迫反應(yīng)，如抗病、抗旱、耐鹽等，并與植物老化也有一定的關(guān)系[3-4]。因此，植物CAT對(duì)維持植物氧化還原平衡和抵御脅迫方面具有重要的作用[5]。

刺五加Eleutherococcus senticosus(Rupr.et Maxim)Maxim是我國(guó)傳統(tǒng)的珍貴藥用植物，具有多種生理活性及藥理作用[6]。一般認(rèn)為包括病原菌及干旱、低溫等在內(nèi)的各種脅迫條件對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的形成具有重要的影響[7]。因此，克隆參與多種脅迫反應(yīng)的刺五加CAT基因并分析其表達(dá)情況，對(duì)揭示其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量差異形成的分子機(jī)理具有重要意義。但目前關(guān)于刺五加的研究多集中在直接參與其次生代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶基因方面[8-10]，尚未見(jiàn)關(guān)于刺五加CAT基因的相關(guān)報(bào)道，致使相關(guān)工作難以開(kāi)展。文中利用cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Ampli fi cation of cDNA Ends，RACE)技術(shù)克隆到刺五加CAT基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并分析了其在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同器官中的表達(dá)，旨在為深入研究CAT對(duì)刺五加生長(zhǎng)及次生代謝的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試刺五加采自黑龍江省雞西市。分別以萌芽期(4月26日)、葉片完全展開(kāi)期(5月26日)、盛花期(6月26日)、果實(shí)快速生長(zhǎng)期(7月26日)、果實(shí)基本成熟期(8月26日)、葉片衰老期(9月26日)的葉片和8月16日的葉片、葉柄、幼莖和根作為提取RNA的試材。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 刺五加總RNA的提取和CAT基因保守區(qū)的獲得

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明，分別提取刺五加1～10號(hào)樣本的總RNA。利用Oligo(dT)18引物，以2μL的總RNA為模板，按照RevertAidTMFirst strand cDNA synthesis Kit的步驟說(shuō)明，分別將各樣本的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的刺五加cDNA為模板，利用簡(jiǎn)并上游引物CATS1：5′- GGAAACAA(C/T)TTCCCTGTC -3′和簡(jiǎn)并下游引物 CATX1：5′- ACCTC(C/T)TC(A/G)TCCCTGTGC -3′，PCR擴(kuò)增刺五加CAT基因的保守區(qū)核苷酸序列。反應(yīng)體系50μL，其中LA Taq酶0.6μL，上下游引物各 1μL，cDNA 3μL，2.5mmol·L-1dNTP 4μL，10×LA Taq Buffer 5μL，補(bǔ) ddH2O 至 50μL。反應(yīng)條件為：95℃，5min；95℃，1min；51.5℃，40s；72℃，50s。35個(gè)循環(huán)后72℃補(bǔ)充延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳、回收后，克隆入PGM-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。將轉(zhuǎn)化成功的菌株送Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.2 RACE技術(shù)獲取刺五加CAT基因cDNA 的末端序列

根據(jù)所獲得的刺五加CATcDNA核苷酸序列，應(yīng)用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)5′RACE擴(kuò)增刺五加CAT基因，5′末端序列的特異性引物CAT52：5′-TCTGGGTGGTGGGAGAAGAAGT-3′和CAT51：5′-GTGAGACTTTGGACTGGGTTTA-3′，及3′RACE 擴(kuò)增刺五加CAT基因3′末端序列的特異性引物CAT32：5′- TGCCCTGCT ATTATCGTTCCTG -3′和 CAT31：5′- CGCTCATC ACAACAATCACCAT -3′。參照羅聰?shù)萚11]的方法，取刺五加總RNA 3μL，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈后，利用5′RACE技術(shù)擴(kuò)增CAT基因cDNA的5′末端序列。參照3′-Full RACE core set Ver.2.0試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增。參照1.2.1中的方法電泳、回收、克隆、測(cè)序。

1.2.3 刺五加CAT基因全長(zhǎng)的拼接、驗(yàn)證與生物信息學(xué)分析

將獲得的刺五加CAT基因的5′、3′末端序列和保守區(qū)序列導(dǎo)入DNAMAN 6.0軟件，進(jìn)行拼接，獲得刺五加CAT基因cDNA的全長(zhǎng)序列。根據(jù)拼接獲得的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含CAT基因起始密碼子的上游引物CATQS：5′-CTCATCAAACAATCCGTCTC-3′和 包 含 終 止密碼子的下游引物CATQX：5′-CTCTTTCTCGCA ATCAACAG-3′，PCR擴(kuò)增CAT基因的 cDNA全長(zhǎng)序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增1 558 bp。反應(yīng)條件為：95℃，5min；95℃，1min；55℃，40s；72℃，100s。30個(gè)循環(huán)后72℃補(bǔ)充延伸10min。PCR擴(kuò)增體系與1.2.2中相同。參照文獻(xiàn)[12]中的方法，利用DNAMAN 6.0、PROSITE、ProtParam、PSORT和SOPMA軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用MEGA 5.21軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 刺五加CAT基因的表達(dá)分析

參照文獻(xiàn)[12]中的方法，利用預(yù)計(jì)擴(kuò)增CAT基因長(zhǎng)度為168 bp的上游引物CATRTS：5′- CTGCCCTGCTATTATCGTTCC-3′，下 游 引 物CATRTX：5′-AAGCCTTCATGGTGATTGTTGTG-3′，和預(yù)計(jì)擴(kuò)增刺五加GAPDH基因長(zhǎng)度為134 bp的引物RGS和RGX，進(jìn)行表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺五加CAT基因的克隆

以刺五加的cDNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物CATS1和CATX1進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，測(cè)序獲得1條長(zhǎng)761 bp的條帶(見(jiàn)圖1)。經(jīng)NCBI的BLAST比對(duì)，確定該序列為刺五加CAT基因cDNA的部分序列。利用CAT52和CAT51引物，5′RACE擴(kuò)增后，測(cè)序獲得CAT基因長(zhǎng)633 bp的5′末端cDNA序列(見(jiàn)圖1)。利用CAT32和CAT31引物，3′RACE擴(kuò)增后，測(cè)序獲得CAT基因長(zhǎng)551 bp的3′末端cDNA序列(見(jiàn)圖1)。將所獲得的保守區(qū)片段與5′、3′末端cDNA序列進(jìn)行拼接，發(fā)現(xiàn)該序列包含刺五加CAT基因的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)。利用CATQS和CATQX引物，以刺五加的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增后，測(cè)序獲得1條長(zhǎng)1 558 bp的條帶(見(jiàn)圖1)，與預(yù)期大小相符。且該序列與拼接獲得的序列完全相同。

圖1 刺五加CAT基因的克隆Fig.1 Clone of CAT gene from E.senticosus

2.2 刺五加CAT基因的生物信息學(xué)分析

刺五加CAT基因全長(zhǎng)1 840 bp(GenBank登錄號(hào)：KF498592)，其中5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)長(zhǎng) 138 bp，3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)長(zhǎng) 223 bp，終止密碼子為TGA，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1 479 bp，3′末端具有poly A尾，編碼492個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為56.689 1 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為7.11。氨基酸序列與人參Panax ginseng、可可Theobroma cacao和棗樹(shù)Ziziphus jujuba的同源性分別達(dá)到96.5％、96.3％和96.3％。通過(guò)NCBI的BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，刺五加的CAT蛋白與其它物種的CAT具有相似的功能結(jié)構(gòu)域。刺五加CAT的14～492氨基酸殘基處為CAT家族的基本輪廓，54～70(FDRERIPERVVHARGAS)氨基酸殘基處為近CAT活性位點(diǎn)保守序列，344～352(RIFSYADTQ)氨基酸殘基處為近血紅素配體保守序列，484～486(SRL)氨基酸殘基處為典型的PTS1(peroxisomal targeting signal)motif，480～482(QKL)氨基酸殘基處為典型的PTS1-like motif。刺五加CAT蛋白不存在跨膜螺旋，定位于過(guò)氧化物酶體。刺五加CAT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有137個(gè)α螺旋，占27.85％；78個(gè)延伸鏈，占15.85％；31個(gè)β折疊，占6.30％；246個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，占50.00％。

2.3 刺五加CAT蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 5.21軟件，將GenBank中登載的13個(gè)物種的CAT蛋白與刺五加的CAT蛋白進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建CAT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖2)。刺五加與同為五加科的人參親緣關(guān)系最近，首先聚為一支，可信度99％。之后其它雙子葉植物聚在一起，進(jìn)而與裸子植物聚為一個(gè)大的分支。單子葉植物單獨(dú)聚為一個(gè)分支后與雙子葉植物和裸子植物聚在一起。這與傳統(tǒng)的分類結(jié)果相一致。

圖2 CAT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of CAT protein

2.4 刺五加CAT 基因的表達(dá)分析

刺五加CAT基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和器官中的表達(dá)量變化如圖3所示。自萌芽開(kāi)始的整個(gè)生長(zhǎng)期中，CAT基因均有表達(dá)，但表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)。在整個(gè)生長(zhǎng)期中，CAT的表達(dá)呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢(shì)。萌芽期、葉片完全展開(kāi)期、盛花期和果實(shí)快速生長(zhǎng)期的表達(dá)量較高，果實(shí)基本成熟期和葉片衰老期的表達(dá)量較低。其中盛花期的表達(dá)量最高，果實(shí)基本成熟期的表達(dá)量最低，前者是后者的1.28倍。

刺五加的CAT基因在葉片、葉柄、幼莖和根中均有表達(dá)，但表達(dá)量具有顯著差異(P＜0.05)(見(jiàn)圖3)。最大表達(dá)量出現(xiàn)在葉柄中，葉片和根次之，莖中的表達(dá)量最低。最高表達(dá)量為最低表達(dá)量的1.48倍。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中所克隆的刺五加CAT基因包含完整的ORF，與人參、可可和棗樹(shù)等的CAT基因的序列同源性均在90％以上，其編碼蛋白具備CAT超家族的標(biāo)志性序列特征，說(shuō)明刺五加的CAT基因的cDNA全長(zhǎng)序列被成功克隆。一般認(rèn)為多數(shù)CAT在被翻譯后，通過(guò)識(shí)別PTS1進(jìn)入過(guò)氧化物酶體發(fā)揮生物學(xué)功能[3]。刺五加CAT蛋白484～486位(SRL)的PTS1 motif與擬南芥、冬棗CAT的PTS1 motif序列相同，且均位于距離CAT蛋白C末端上游的第7～9位氨基酸殘基處，行使增強(qiáng)CAT向過(guò)氧化物酶體轉(zhuǎn)運(yùn)效率的功能[13]。而480～482位(QKL)的PTS1-like motif，為CAT家族的C端保守序列，在CAT與PTS1受體蛋白Pex5p的相互識(shí)別中發(fā)揮著重要的作用[14]。

圖3 刺五加不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期及器官中CAT基因的表達(dá)變化Fig.3 Expression variations of CAT gene during different growth and development stages and in different organs of E.senticosus

根據(jù)CAT表達(dá)的時(shí)空特點(diǎn)，可將CAT分為在光合組織中高表達(dá)的類型I、在維管組織中高表達(dá)的類型II和在生殖組織與生殖時(shí)期高表達(dá)的類型III[15]。系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果表明，刺五加的CAT與屬于類型III的玉米CAT1、水稻CATB[15]的親緣關(guān)系顯著近于其它2種類型。同時(shí)表達(dá)量的分析結(jié)果也表明，刺五加的CAT在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，但盛花期的表達(dá)量最高的特點(diǎn)也與同屬類型III的人參CAT相符[16]。因此，初步判定研究所克隆的刺五加CAT屬類型III。

已有的研究表明，CAT的表達(dá)受植物的發(fā)育時(shí)期、組織和器官類型的顯著影響。刺五加CAT自萌芽后開(kāi)始至果實(shí)快速生長(zhǎng)期始終高表達(dá)的特點(diǎn)與玉米中同屬類型III的CAT1在幼葉期至授粉后21～30d始終高表達(dá)[17]的特點(diǎn)完全相符。而刺五加CAT在葉柄中表達(dá)量最高，葉片中相對(duì)較低的特點(diǎn)則與人參CAT[16]的表達(dá)規(guī)律相同。

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