利用RAMP分子標(biāo)記對酸棗資源的遺傳多樣性分析

張建英，毛向紅，張瑩瑩

(1.河北省林木良種工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050061；2.河北省林業(yè)科學(xué)研究院，河北 石家莊 050061)

酸棗Ziziphus acidojujubaC.Y原產(chǎn)我國，在我國分布極為廣泛，是棗的原生種，距今已有1 200萬年以上的歷史[1]。酸棗具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，其保健功能早已得到了人們的認(rèn)可，以酸棗為原料的加工產(chǎn)品受到了現(xiàn)代人的青睞。目前有關(guān)酸棗的研究主要集中在果肉、種仁、酸棗葉等器官的營養(yǎng)價值和藥理作用以及加工等方面。

遺傳多樣性具有廣泛性、特異性和適應(yīng)性等特點，遺傳變異廣泛存在于自然界各種生物體內(nèi)，是生物進(jìn)化的根本動力[2]。酸棗在長期的進(jìn)化過程中，經(jīng)過自然選擇和人為因素的綜合作用，產(chǎn)生了大量的變異，種質(zhì)資源極為豐富。關(guān)于酸棗分子水平上的研究報道較為鮮見，為了更好地開發(fā)利用酸棗資源，獲得更高的效益，有必要對其進(jìn)行相關(guān)的遺傳學(xué)研究[3]。近年來，隨著對棗種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的起步，分子標(biāo)記技術(shù)在棗種質(zhì)資源鑒定方面的應(yīng)用逐漸增多，劉孟軍[4]首次采用RAPD分析方法，將親緣關(guān)系極近的金絲小棗和無核小棗區(qū)分開來。趙錦[5]通過RAPD分析從DNA水平上揭示了棗屬中棗、酸棗和毛葉棗3個種之間的親緣關(guān)系，同時建立了供試材料的RAPD指紋。但RAPD技術(shù)對外界條件的微小變化反應(yīng)太過敏感，受反應(yīng)條件的影響較大，相對來說，RAMP技術(shù)能更準(zhǔn)確地揭示物種間的遺傳關(guān)系[6]。本試驗中嘗試用RAMP技術(shù)對31份采自不同區(qū)域的酸棗種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在闡明該樹種不同區(qū)域生長群體間存在的遺傳差異，保護(hù)該樹種基因資源多樣性，同時為酸棗新品種培育工作的種源選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗中所用酸棗樣品于2011年7月采自河北省的石家莊、懷來、赤城、遵化、隆化、涉縣，山西省的汾陽以及遼寧省。樣品共計31份(見表1)，包括27份酸棗資源、4個大棗品種。1～21號樣品采自從原產(chǎn)地引進(jìn)接穗嫁接到河北省林業(yè)科學(xué)研究院資源圃的植株。

表1 供試酸棗樣品Table 1 The tested samples in Z.acidojujuba

采集健康植株的幼嫩葉片，采后立即用錫箔紙包裹并置于液氮瓶中冷凍，帶回后存放于-70℃的超低溫冰箱中待測。

試驗中所用引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TaqDNA聚合酶和dNTP購自大連寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

酸棗基因組DNA的提取采用改良CTAB法[7]。

(1)將高鹽CTAB緩沖液在65℃離心管中預(yù)熱處理。

(2)稱取150mg新鮮、干凈酸棗葉片置于1.5mL離心管中，先加入500μLDNA預(yù)處理液快速研成粉末，再加入500μL預(yù)處理液，然后與預(yù)熱的高鹽CTAB 緩沖液充分混勻，65℃水浴條件下60min，其間上下顛倒混勻幾次。

(3)取出離心管，室溫下冷卻4～5min，吸取上清液，加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(25︰24︰1)混勻，室溫下靜置5min，于室溫下12 000g離心8min。

(4)取上清液，加入等體積的氯仿、異戊醇混合液(24︰1)，充分混勻后室溫靜置5min，室溫下12 000g離心8min；取上清液，重復(fù)加等體積氯仿、異戊醇混合液(24︰1)抽提。

(5)取上清液，加入等體積氯仿抽提1次。

(6)取上清液，加入2倍體積的-20℃的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃沉淀30min以上，12 000g離心10min。

(7)將所得沉淀風(fēng)干至透明狀，然后溶于100μL水中，放于4℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)與電泳[5]

優(yōu)化酸棗DNA基因組RAMP-PCR 10μL反應(yīng)的最優(yōu)條件為：Mg2+濃度3.0mmol/L，引物濃度1.0 μmol/L，dNTPs濃度 0.15mmol/L，TaqDNA 酶為1.5 U。

擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95℃，4min；95℃，50s；50℃，50s；72℃，1.5min，共30個循環(huán)。完成最后1個循環(huán)后72℃下延伸10min。

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1％ AgNO3染色10min，顯色液(1.5％NaOH，0.4％甲醛)顯色，然后用10％乙醇0.5％乙酸固定，最后觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 31份樣品的RAMP分析

RAMP擴(kuò)增選用5′錨定的引物即 GC(CA)4和GT(CA)4與上海生工生物工程公司生產(chǎn)的十聚體隨機(jī)引物組成對材料進(jìn)行擴(kuò)增篩選，從中共篩選出具有明顯擴(kuò)增產(chǎn)物的14條引物組合用于試驗。擴(kuò)增結(jié)果見表2。由表2可以看出，RAMP1+S427、RAMP+S485、RAMP+S26引物組合多態(tài)性較高，達(dá)到90％以上；RAMP1+S372引物組合最低，為33.3％；其余引物介于中間。14條引物共擴(kuò)增出112條DNA片段，其中87條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為77.7％，每個引物擴(kuò)增出1～10條多態(tài)性帶，平均每條引物擴(kuò)增6.2條，說明采集的樣品在分子水平上存在較大的差異。

圖1為以RAMP1+RAMP2F組合為引物的部分酸棗PCR樣品電泳圖譜，以RAMP為引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小主要分布在300～700 bp之間。

表2 14條引物對酸棗樣品的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplification result of the samples in Z.acidojujuba by using 14 primers

圖1 以RAMP1+RAMP2F為引物的部分酸棗PCR樣品電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of partial PCR samples in Z.acidojujuba by using RAMP1+RAMP2F as the primer

2.2 31份樣品的的遺傳關(guān)系分析

對31份樣品經(jīng)RAMP-PCR擴(kuò)增的300～700 bp范圍內(nèi)條帶分別賦值，同一位置有帶的記為1，無帶的記為0。按照Nei和Li方法計算遺傳相似系數(shù)[8]。根據(jù)14條引物對樣品基因組DNA的隨機(jī)擴(kuò)增結(jié)果，通過計算，建立樹狀聚類圖(見圖2)。由圖2可知，31份樣品間的遺傳距離范圍為0.120 9～0.517 2。其中，3號井22A和6號井22C間遺傳距離最小，為0.120 9；5號井21和其它樣品間遺傳距離均較大，與27號新立河南1的遺傳距離最大，為0.517 2。

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果將參試的31份樣品在遺傳距離0.34處做結(jié)合線，可將其分為6大類。

第1大類包括18份樣品，可以將其分為3組：第1組包括1號、8號、13號、 3號、6號、10號、4號、7號、9號、24號10個酸棗樣品和20號、21號2個大棗品種；第2組包含2號、16號、15號3個酸棗樣品和1個大棗樣品(18號唐星)；第3組為12號和14號樣品。這一類中除了第1組中的20號、21號2個大棗品種和24號酸棗樣品外，其它15份樣品均原產(chǎn)于河北省中南部的石家莊和保定。

第2大類包括11份樣品，可以分為2組：第1組為22號、23號、27號、29號、30號、28號6個樣品，采自河北省東北部的懷來、遵化以及與河北東北部交界的遼寧省；第2組為25號、26號和31號3份樣品，采自河北省的隆化、涉縣和山西汾陽。

第3～6大類各只包括1份樣品，分別為11號‘武GY08’、19號‘曙光’、5號‘井21’、17號‘易GY13’，均來源于河北中南部。

圖2 31份酸棗樣品聚類分析Fig.2 Cluster analysis on 31 samples in Z.acidojujuba

3 結(jié)論與討論

樣品多態(tài)性分析結(jié)果表明，在24條引物中篩選出14條對31份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出112個片段，其中87條具有多態(tài)性，占總擴(kuò)增帶數(shù)的77.7％，顯示出供試樣品具有豐富的遺傳多樣性。表明利用RAMP分子標(biāo)記技術(shù)能夠把供試材料區(qū)分開并表明它們之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，此項技術(shù)的應(yīng)用能夠為酸棗品種鑒定、保護(hù)及應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

樣品的聚類分析結(jié)果表明，最少通過4對引 物(RAMP1+S427、RAMP1+S485、RAMP1+RAMP2F、RAMP1+S26)可以對 31個酸棗品種進(jìn)行聚類；31份樣品間的遺傳距離為0.120 9～0.517 2，3號井22A和6號井22C間遺傳距離最小，而且二者產(chǎn)地相同，由此推斷在起源上有共同的遺傳來源；5號井21與其它樣品間遺傳距離較大，與27號新立河南1的遺傳距離最大，表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果可將參試的31份資源劃分為6類，酸棗資源沒有首先聚成一類，和4個大棗品種之間也無明顯的分類界限，有的酸棗之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)于大棗，冬棗、新星、唐星、曙光4個大棗品種也未聚成一類。棗與酸棗均屬于鼠李科棗屬植物，但二者的分類存在較大爭議[9]。根據(jù)試驗結(jié)果進(jìn)行推測，酸棗向大棗演變的過程是極為復(fù)雜的，不同區(qū)域酸棗的進(jìn)化階段并不相同，酸棗向大棗的進(jìn)化是通過多條路徑在不同的地理區(qū)域完成的。

在每一類組里除了個別樣品外大都表現(xiàn)為地理位置接近的資源聚為一組，表現(xiàn)出了地源優(yōu)先的原則，但也有個別樣品例外。酸棗的發(fā)展演變經(jīng)歷了上千萬年的歷史，一些個體從一個群體到另一個群體的遷移會把某種基因帶到新的群體，從而產(chǎn)生基因的流動?；ǚ酆头N子的擴(kuò)散與傳播更是自然界普遍存在的現(xiàn)象，這2種傳播方式是基因流動的主要形式[10]。因此，個別樣品的聚類可能受到試驗過程中的誤差或者資源本身曾經(jīng)經(jīng)歷的基因流動[11-13]的影響。

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