當(dāng)歸芍藥散對(duì)蛋雞O V R基因表達(dá)的影響

■ 吳國(guó)江 魏 萌 韓愈杰 秦桂芳

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001；2.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北保定071001)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，蛋雞產(chǎn)蛋率的高低將直接影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，然而在蛋雞飼養(yǎng)管理過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降的情況，雖造成產(chǎn)蛋率下降的原因很多，但多數(shù)都是因卵泡發(fā)育減少或停滯[1]所致。在正常情況下，卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程易受促卵泡素、促黃體素、雌激素、血清卵黃前體物等多種生理因素影響，其中卵黃前體物極低密度脂蛋白(VLDL)和卵黃生成素(VTG)[2]是蛋黃形成的基礎(chǔ)，二者在卵細(xì)胞卵黃生成受體(OVR，oocyte vitellogenesis receptor)[3]介導(dǎo)下，經(jīng)內(nèi)吞方式被轉(zhuǎn)運(yùn)到卵泡中，并促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[4]，進(jìn)而提高產(chǎn)蛋率，因此雞細(xì)胞卵黃生成受體（OVR）基因表達(dá)量變化是改善蛋雞產(chǎn)蛋率重要因素[5]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在當(dāng)歸芍藥散的現(xiàn)代藥理學(xué)研究方面做了大量的工作，闡述當(dāng)歸芍藥散在治療婦科疾病以及對(duì)血管神經(jīng)系統(tǒng)等方面的作用機(jī)制[6]，證實(shí)了當(dāng)歸芍藥散具有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、提高卵巢功能[7]、改善血液流動(dòng)性和調(diào)節(jié)血液凝固纖溶系統(tǒng)等作用。本研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，β-actin為內(nèi)參基因[8]，通過(guò)構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，觀察不同濃度當(dāng)歸芍藥散添加量對(duì)OVR基因mRNA的表達(dá)水平的影響，探討中藥對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋性能作用機(jī)制，為臨床研究中藥提高產(chǎn)蛋率的分子學(xué)機(jī)制提供方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

當(dāng)歸芍藥散：當(dāng)歸、白芍、茯苓、川芎、澤瀉、白術(shù)，均購(gòu)自安國(guó)市中藥市場(chǎng)，各味藥按處方稱好，粉碎，按1%、1.5%、2%、2.5%、3%的比例與全價(jià)配合料混合均勻，干燥放置備用。

試驗(yàn)動(dòng)物：39周齡海蘭褐商品蛋雞。

1.2 主要儀器和試劑

TY4133凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）；Rotor-GeneTM6000熒光定量PCR儀(Corbett Research公司)；TGradient溫度梯度PCR儀（Biometra公司）；超微量分光光度計(jì)（thermo scientific公司）。 TransZol Up，TransScript First-Strand cDNA合成試劑盒、Easy-Pure Quick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、Trans-Start DNA Polymerase質(zhì)粒提取試劑盒、pEASY-T3 Cloning Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、Trans-Start Green qPCR SuperMix（均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)雞為39周齡海蘭褐商品蛋雞，飼糧預(yù)試2周，每天記錄產(chǎn)蛋量、蛋重及耗料量，淘汰不產(chǎn)蛋、精神狀態(tài)差的試驗(yàn)雞，且體況和產(chǎn)蛋率無(wú)顯著差異(P＞0.05)后開(kāi)始正式試驗(yàn)。選取288只雞，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為6組，每組4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)12羽，第2組至第6組分別飼喂添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%中藥試驗(yàn)飼糧，第1組為空白對(duì)照組，試驗(yàn)期8周。各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，半開(kāi)放式雞舍，自由采食與飲水，人工補(bǔ)光，機(jī)械通風(fēng)，定期清糞，消毒。

1.4 樣品的采集與制備

試驗(yàn)第8周末，每組隨機(jī)抽取8只雞，無(wú)菌、無(wú)RNAase下，剖開(kāi)腹腔，取出排卵前卵泡顆粒層、小黃卵泡（SYF）和大白卵泡（LWF）迅速用已經(jīng)滅菌的鋁箔紙包裹，放于標(biāo)記好的紗布袋中放液氮速凍，然后至-80℃的超低溫冰箱保存以備測(cè)定OVR基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 OVR基因mRNA水平的測(cè)定

1.5.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的OVR基因的mRNA序列（登錄號(hào)GI45382562），運(yùn)用Oligo 7軟件在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物：5′-AGCAAAATGTGAGGAGTCCCAG-3′，下 游 引 物 ：5′-AAGCACTTTCATCACTGCCGTC-3′，目的片段長(zhǎng)度為110 bp。內(nèi)參基因選用β-actin基因，上游引物：5′-CTGTGCCCATCTATGAAGGCTA-3′，下 游 引 物：5′-ATTTCTCTCTCGGCT-GTGGTG-3′，序列引物合成由北京全式金生物技術(shù)有限公司完成。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.5.2 RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄

海蘭褐種母雞卵泡總RNA的抽提使用Trizol法提取。cDNA的合成按反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.3 引物特異性鑒定標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增OVR基因，反應(yīng)體系為25 μl：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs（10 mmol/l）2 μl，上、下游引物（10 mmol/l）各0.5 μl，Taq酶0.3 μl、cDNA 1 μl，加滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至 25 μl。循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、61℃退火30 s、72℃延伸30 s（35個(gè)循環(huán)），72℃終末延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。膠回收的PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，用Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit提取重組質(zhì)粒，送北京全式金生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，參考Giulietti[9]方法計(jì)算拷貝數(shù)。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以10倍梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在Rotor-GeneTM6000熒光定量PCR儀上擴(kuò)增并檢測(cè)熒光，獲得模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)和臨界循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程。

PCR反應(yīng)為12.5 μl體系：TransStartTMGreen Qp-cr SuperMix(2×)10 μl，上、下游引物各0.25 μl(10 μM),稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品模板1 μl，加滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至12.5 μl。

反應(yīng)條件：95℃ 5 min；隨后進(jìn)行40個(gè)95℃ 5 s，61℃ 15 s，72℃ 10 s的循環(huán)，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.6 OVR基因的表達(dá)量研究

用以上所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)不同當(dāng)歸芍藥散添加量對(duì)OVR基因的影響。為了進(jìn)一步清晰地表示出中藥添加組與正常對(duì)照組基因表達(dá)之間的關(guān)系，將對(duì)照組的基因表達(dá)量調(diào)整為1，即用對(duì)照組以及中藥添加組的基因表達(dá)量除以對(duì)照組基因表達(dá)量的均值，采用唐中林等（2008）[10]的計(jì)算方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，方差分析使用One-way anova，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性鑒定

OVR基因的PCR擴(kuò)增片段在約110 bp處出現(xiàn)1條特異性條帶，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期結(jié)果相符(見(jiàn)圖1)，序列經(jīng)克隆、測(cè)序分析表明擴(kuò)增片段為目的片段。

圖1 OVR基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆、測(cè)序后作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍系列稀釋，選取1.83×102～1.83×107拷貝/μl 6個(gè)稀釋度進(jìn)行real-time PCR，擴(kuò)增曲線（見(jiàn)圖2），以Ct值為縱坐標(biāo)，稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明，real-time PCR在1.83×102～1.83×107拷貝/μl反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 14，擴(kuò)增效率為102%。熔解曲線分析表明，無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物呈特異的單個(gè)峰，其Tm為(82±0.5)℃(見(jiàn)圖4)。

圖2 動(dòng)力學(xué)曲線

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 熔解曲線

2.3 OVR基因的表達(dá)研究

表1結(jié)果表明，飼料中添加2%的當(dāng)歸芍藥散對(duì)雞OVR基因的表達(dá)量有極顯著影響。

表1 當(dāng)歸芍藥散對(duì)雞OVR基因的表達(dá)量的影響

3 討論

在蛋雞繁殖活動(dòng)中，卵母胞膜表面蛋白OVR數(shù)量是影響卵細(xì)胞發(fā)育成熟的重要因素之一[11]，且在雞體內(nèi)，OVR只在卵巢中表達(dá)，其他組織幾乎無(wú)任何表達(dá)[12-13]。OVR是由位于Z染色體上的基因編碼，激素、食物等因素可調(diào)控OVR mRNA的表達(dá)量[14-15]，若編碼OVR基因位點(diǎn)發(fā)生突變，即使循環(huán)血量極低密度脂蛋白(VLDL)卵黃生成素(VTG)含量正常，卵母胞因缺乏具有介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞功能的OVR而不能發(fā)育成熟，導(dǎo)致產(chǎn)蛋能力下降[16]，因此研究卵細(xì)胞卵黃生成受體(OVR)調(diào)控基因的表達(dá)量，對(duì)提高產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能尤為重要[17]，本研究采用通過(guò)PCR擴(kuò)增考察調(diào)控OVR基因表達(dá)量，分析當(dāng)歸芍藥散對(duì)雞卵泡發(fā)育過(guò)程中OVR基因表達(dá)量變化。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR按著PCR動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律，通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，并以熒光信號(hào)由本底開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所需要的最少循環(huán)數(shù)(稱為循環(huán)閥值,Ct)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，反映熒光信號(hào)與模板濃度對(duì)數(shù)間的線性關(guān)系[18]，現(xiàn)已成為定量分析mRNA表達(dá)水平最廣泛使用的技術(shù)之一[19]，并在分子診斷、基因表達(dá)研究、分子生物學(xué)研究、動(dòng)植物檢疫以及食品安全檢測(cè)等方面有廣泛的應(yīng)用[20]。

試驗(yàn)采集飼喂不同濃度當(dāng)歸芍藥散的蛋雞卵泡，建立了OVR基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，結(jié)果顯示，擴(kuò)增效率為102%，檢測(cè)范圍Ct值為10～27，熔解曲線為特異的單峰，檢測(cè)范圍間有良好的線性關(guān)系（R2=0.999 14），通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)添加1%、1.5%、2%、2.5%、3%5個(gè)濃度當(dāng)歸芍藥散的雞卵泡，發(fā)現(xiàn)飼料中當(dāng)歸芍藥散添加量為2%時(shí)，對(duì)OVR基因有極顯著影響（P＜0.01）。由此可以看出當(dāng)歸芍藥散對(duì)雞產(chǎn)蛋率有很好調(diào)控作用。

4 結(jié)論

①本研究所建立的SYBR Green I熒光定量PCR特異、快速、準(zhǔn)確?？捎糜跍y(cè)定雞OVR基因的表達(dá)量。

②當(dāng)歸芍藥散可調(diào)控蛋雞的OVR基因表達(dá)，影響蛋雞產(chǎn)蛋率。