殺真菌素鏈霉菌變溫發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的研究

■潘春梅 王 靜 張曉靜

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院生物工程系，河南鄭州 450046)

恩拉霉素是由殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fun?gicidicus)發(fā)酵產(chǎn)生的多肽類動物專用抗生素，又名持久霉素、安來霉素。恩拉霉素是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有機堿，其中氨基酸分子構(gòu)成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端[1]。恩拉霉素具有較高的穩(wěn)定性，在制成顆粒料過程中非常穩(wěn)定，與飼料混合后在室溫下長期儲藏效價下降甚微。恩拉霉素在腸道內(nèi)不被降解，對革蘭氏陽性菌具有較強的抑制和殺滅作用[2]。它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用機制缺乏特異性，敏感菌幾乎不對其產(chǎn)生耐藥性，并且與其他類抗生素不易產(chǎn)生交叉耐藥性[3]。在飼料中添加微量恩拉霉素能改變動物腸道內(nèi)的微生物群落分布，有利于飼料營養(yǎng)成分的消化吸收，促進(jìn)動物生長和提高飼料利用率，并且在畜禽體內(nèi)殘留量非常低[4]。恩拉霉素具有的這些良好特性，使其被世界上許多國家推薦作為抗菌促生長劑。

恩拉霉素于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社研發(fā)，Higashiide等[5]首次報道了從土壤樣品中分離恩拉霉素發(fā)酵菌種Streptomyces fungicidicus No.B5477。1973年日本正式批準(zhǔn)該藥為抗生素飼料添加劑并應(yīng)用至今。1993年我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)該藥在我國注冊，2005年國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)與美國先靈葆雅動物保健品有限公司開始合作生產(chǎn)恩拉霉素預(yù)混劑。迄今為止，關(guān)于恩拉霉素的發(fā)酵生產(chǎn)在國內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報道，且有關(guān)變溫發(fā)酵法生產(chǎn)恩拉霉素的研究未見報道。

本文利用Streptomyces fungicidicus L12為發(fā)酵菌株，研究不同溫度對菌體生長、碳源消耗和恩拉霉素生成的影響，在此基礎(chǔ)上利用正交試驗設(shè)計法系統(tǒng)研究變溫策略對菌株發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的影響，優(yōu)化了變溫發(fā)酵工藝，取得了有意義的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 菌種

殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)L12，由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院保存。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)基（g/l）：玉米粉30，葡萄糖15，大豆油5，氯化銨2，磷酸二氫鉀0.3，硫酸鎂4，消泡劑0.05。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖35，玉米粉45，玉米蛋白粉35，玉米漿15，氯化銨0.6，硫酸鎂0.2，葵花油5，初始pH值7.1。

取一環(huán)斜面菌種接至搖瓶種子培養(yǎng)基中，30℃、轉(zhuǎn)速230 r/min條件下培養(yǎng)，當(dāng)搖瓶種子菌濃度大于20%(離心后體積分?jǐn)?shù))、pH值持續(xù)下降、發(fā)酵36～48 h、顯微鏡鏡檢菌絲為舒展網(wǎng)狀時，將種子液按10%接種量接至發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，通氣比為1∶1，轉(zhuǎn)速為500 r/min。

1.3 樣品處理

移取15 ml提取液（甲醇∶水=7∶3、pH值3.0）于小燒杯中，用吸管準(zhǔn)確加入2 ml充分搖勻的發(fā)酵液于上述小燒杯中，用0.2 mol/l鹽酸調(diào)節(jié)至pH值3.0。將燒杯中混合液倒入25 ml比色管中，用提取液定容至刻度線，搖勻、超聲20 min，搖勻，取10 ml倒入離心管中，4 000 r/min離心10 min。吸取上清液，用0.45 μm有機過濾膜過濾。

1.4 分析方法

1.4.1 恩拉霉素效價測定

采用HPLC法測定發(fā)酵液效價。流動相為0.05 mol/l的乙腈與磷酸二氫鈉混合液，體積比為3∶7，用磷酸調(diào)pH值至4.5。采用色譜柱waters C18，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl，檢測波長為267 nm，運行時間為20 min。

1.4.2 總糖含量測定

總糖含量采用菲林法進(jìn)行分析測定[6]。

2 結(jié)果及討論

2.1 溫度對殺真菌素鏈霉菌L12的恩拉霉素發(fā)酵影響

溫度影響微生物細(xì)胞的各種代謝過程，在抗生素發(fā)酵中，細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物的積累的溫度往往是不一樣的，例如：青霉素產(chǎn)生菌生長的最適溫度是30℃，但產(chǎn)生青霉素的最適溫度是24.7℃。在殺真菌素鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素過程中采取何種溫度，取決于當(dāng)時菌體生長與產(chǎn)物合成哪一個是主要方面。

本文系統(tǒng)研究了在恒溫條件下殺真菌素鏈霉菌發(fā)酵過程中菌體生長量、總糖含量和恩拉霉素產(chǎn)量的變化情況，在50 L發(fā)酵罐上分批培養(yǎng)，溫度分別控制在25、27、29、31 ℃和33 ℃，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵溫度對殺真菌素鏈霉菌L12菌體生長、總糖含量和恩拉霉素產(chǎn)量的影響

由圖1A可以看出，當(dāng)溫度過高（33℃）或者過低（25℃）時都會抑制殺真菌素鏈霉菌L12細(xì)胞的生長。25℃條件下，菌株的延遲期最長，在27～31℃溫度范圍內(nèi)，菌株的生長速度隨著溫度的提高而增快，菌株生長的延遲期會縮短。當(dāng)溫度在31℃條件下，細(xì)胞生長量達(dá)到最大值26.8 g/l；由圖1B可知，在測試溫度范圍內(nèi)，菌株培養(yǎng)至30 h后，發(fā)酵液的總糖含量急劇下降。溫度在27～31℃范圍內(nèi)時，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中殘?zhí)呛枯^低，維持在13.8～16.4 g/l之間；由圖1C可以看出，在25℃條件下培養(yǎng)，發(fā)酵液中恩拉霉素產(chǎn)量最低，這主要是由于在此低溫下細(xì)胞生長受抑制，細(xì)胞的生物量過低所致。在27～31℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，細(xì)胞生長速度加快，產(chǎn)物合成速度也隨之加快。當(dāng)溫度控制在相對較低水平（27℃）培養(yǎng)時，雖然恩拉霉素合成速度比29℃和31℃培養(yǎng)時低，但是其持續(xù)時間長，最終的恩拉霉素產(chǎn)量最大，達(dá)到5 915 U/ml。

2.2 變溫發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

由圖1的試驗結(jié)果分析可以看出，如果采用變溫培養(yǎng)的控制策略，在發(fā)酵前期通過適當(dāng)提高發(fā)酵溫度以增加細(xì)胞量，在發(fā)酵中后期適當(dāng)降低發(fā)酵溫度以維持較高的恩拉霉素發(fā)酵水平，有可能會大幅度提高恩拉霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。

對于變溫發(fā)酵控制而言，選擇合適的前期培養(yǎng)溫度、后期培養(yǎng)溫度和變溫時間點是最為關(guān)鍵的。為了優(yōu)化殺真菌素鏈霉菌L12變溫發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的最佳工藝參數(shù)，本文按照L9(34)正交表設(shè)計了三因素三水平的正交試驗，因素水平及試驗設(shè)計見表1，正交試驗的結(jié)果及直觀分析見表2。

表1 恩拉霉素生產(chǎn)變溫發(fā)酵條件試驗因素水平

表2正交試驗結(jié)果和直觀分析可以看出，前期培養(yǎng)溫度(A)、后期培養(yǎng)溫度(B)和變溫時間點(C)均對恩拉霉素的發(fā)酵有顯著影響。因素的水平變動時，試驗指標(biāo)的變動越大，即該因素對試驗指標(biāo)的影響越大，從而可按極差的大小決定因素的主次順序。比較三個因素的極差R值：B＞A＞C，這說明后期培養(yǎng)溫度是影響恩拉霉素產(chǎn)量的最重要的因素，前期培養(yǎng)溫度A次之，變溫時間點C最次。由直觀分析可知，本試驗考察的三個因素的最佳水平均在考察的范圍內(nèi)，當(dāng)以恩拉霉素產(chǎn)量為指標(biāo)時，最優(yōu)的變溫發(fā)酵工藝條件為B2C2A2，即前期培養(yǎng)溫度31℃、后期培養(yǎng)溫度27℃，變溫時間點70 h的條件下恩拉霉素產(chǎn)量達(dá)最大。

表2 恩拉霉素變溫發(fā)酵正交試驗的結(jié)果與直觀分析

2.3 變溫發(fā)酵控制策略的驗證

通過正交試驗，確定最優(yōu)的變溫發(fā)酵條件為：先在31℃培養(yǎng)70 h，然后降低溫度至27℃培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。采用優(yōu)化的變溫條件進(jìn)行殺真菌素鏈霉菌L12的恩拉霉素發(fā)酵驗證試驗，恩拉霉素產(chǎn)量達(dá)到了6 687 U/ml，與優(yōu)化前相比較，恩拉霉素產(chǎn)量提高了13%。

3 結(jié)論

在發(fā)酵過程中，采用變溫控制模式，即0～70 h發(fā)酵溫度為31℃，70 h后發(fā)酵溫度降為27℃培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。這種變溫發(fā)酵有利于菌體正常生長代謝,從而促進(jìn)恩拉霉素的合成，恩拉霉素產(chǎn)量最高達(dá)到6 687 U/ml，與優(yōu)化前相比較，恩拉霉素產(chǎn)量提高了13%。