多巴胺激動劑阿樸嗎啡對東莨菪堿誘導小鼠學習記憶障礙的影響*

楊慧娣，楊 錚，劉陶迪

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，呼和浩特010110）

海馬和杏仁核是大腦邊緣系統(tǒng)獨立的而又相互聯(lián)系的兩個部位，大腦邊緣系統(tǒng)被認為是調(diào)節(jié)記憶的重要部位。來自兩個記憶系統(tǒng)的這兩個結(jié)構(gòu)可以根據(jù)處理信息的不同，而又存在功能性的區(qū)分。在嚙齒動物中，海馬區(qū)是調(diào)節(jié)非自我學習的重要腦區(qū)，非自我學習與獨立的線索和位置有關(guān)；而杏仁核是聯(lián)接不同環(huán)境線索和生物刺激（例如食物和損傷等）的重要腦區(qū)［1］。損傷杏仁核或者海馬任意一個腦區(qū)有時能增加另外一個腦區(qū)處理記憶進程的能力。這暗示這兩個腦區(qū)大部分是獨立的，它們一些重疊的部位具有競爭特征。然而，在重疊區(qū)，這兩個腦區(qū)可能是相互合作的。特別是，增加杏仁核的活性與增強的海馬獨立調(diào)節(jié)的空間記憶有關(guān)［2］。

伏隔核（nucleus accumbens，NAcc）是邊緣系統(tǒng)和運動的交互點，伏隔核將動機行為轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕藢蛐袨椤Ｉ窠?jīng)生理學和神經(jīng)解剖學的研究已經(jīng)揭示了可能的神經(jīng)機制，伏隔核及伏隔核內(nèi)的多巴胺神經(jīng)元（dopamine，DA）的分支選擇和整合邊緣和皮質(zhì)的神經(jīng)投射，而這些神經(jīng)可以調(diào)控行為。研究發(fā)現(xiàn)伏隔核的殼通過空間／背景信息調(diào)控獎賞和藥物成癮行為。伏隔核的核通過獨立的線索調(diào)控各種的行為?；缀说亩喟桶吩谡{(diào)節(jié)學習行為方面起到關(guān)鍵作用，然而，大腦邊緣系統(tǒng)中的多巴胺神經(jīng)元是否調(diào)節(jié)與學習記憶相關(guān)的行為還不清楚［3］。本研究的目的是測試大腦邊緣系統(tǒng)的多巴胺神經(jīng)元是否調(diào)控記憶行為。我們假設(shè)多巴胺的激動劑阿樸嗎啡能減輕東莨宕堿誘導的小鼠記憶障礙。本實驗用東莨菪堿誘導小鼠的記憶障礙，為了研究多巴胺神經(jīng)元對記憶的作用，檢測腹腔注射多巴胺的激動劑阿樸嗎啡后對小鼠的記憶的影響。我們使用即刻早期基因Fos蛋白標記細胞活性，酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH；多巴胺轉(zhuǎn)化的限速酶）標記多巴胺神經(jīng)元，共表達Fos／TH細胞表示有活性的多巴胺細胞，使用免疫組織化學的方法研究腦組織各區(qū)的多巴胺細胞的活性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼養(yǎng)

雄性昆明小鼠，體重20 g，內(nèi)蒙古大學實驗動物中心提供，清潔級。單籠飼養(yǎng)，飼料為普通飼料，自由攝食飲水。每日更換飲水和飼料，保持動物生活環(huán)境通風及清潔衛(wèi)生。動物房內(nèi)溫度為（22±1）℃，光照時間為每日 8∶00～20∶00。

1.2 實驗設(shè)計和方法

1.2.1 東莨菪堿誘導的記憶障礙與多巴胺神經(jīng)元的關(guān)系 30只雄性小鼠隨機分成3組（n＝10），注射生理鹽水組（對照組：NS組），腹腔注射氫溴酸東莨菪堿溶液 0.3 mg／kg（SCOP 0.3）和 3.0 mg／kg（SCOP 3.0），連續(xù)注射 60 d。注射藥物的第 53天和第60天測定避暗行為。第60天測定行為結(jié)束后，將動物麻醉后灌注取腦做免疫組化。

1.2.2 多巴胺激動劑阿樸嗎啡與東莨菪堿誘導的小鼠記憶障礙 40只雄性小鼠隨機分成4組（n＝10），腹腔注射東莨菪堿 3.0 mg／kg，連續(xù)注射 60 d。注射藥物的第53天和第60天測定避暗行為，確定造模成功后，一組注射100μl的生理鹽水（NS），另三組分別注射 100μl的阿樸嗎啡 0.1 mg／kg（APO 0.1）、0.5 mg／kg（APO 0.5）和 2.0 mg／kg（APO 2.0，n＝10）。連續(xù)給藥30 d，在注射阿樸嗎啡第23天和30天測定記憶行為。第30天行為測定后將動物麻醉后灌注取腦做免疫組化。

1.2.3 小鼠記憶行為檢測 避暗箱由控制器（明室）和活動箱（暗室）兩部分組成，由門洞相連。測試和記錄小鼠第一次從明室進入暗室的潛伏期和受到電擊的錯誤次數(shù)。實驗時將小鼠頭部背對著洞口放入明室，打開門洞，實驗時間開始倒計時。若某室的小鼠從明室進入暗室中，則潛伏期計時停止，同時在暗室內(nèi)施與36 V的電刺激，此時所顯示的值即為該小鼠的潛伏期，錯誤次數(shù)顯示值為1。小鼠在暗室中受到電擊后逃出，錯誤次數(shù)加1。在注射藥物的第53天，對小鼠進行訓練，記錄小鼠的潛伏期（latency）和 5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)（number of mistaken），并在7 d后（即第60天）進行測試，同樣記錄小鼠的潛伏期和5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)。如果5 min時小鼠仍未進入暗室，錯誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為300 s。

1.2.4 多巴胺神經(jīng)元 （DA）表達的檢測：免疫組織化學法 實驗動物以10 g／L戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg／kg），經(jīng)左心室向升主動脈勻速灌注 37℃生理鹽水和4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（pH 7.2，0.1 mol／L）。將腦移入多聚甲醛中固定4 h。移入含30%蔗糖的磷酸緩沖液中，4℃過夜。-20℃冰凍連續(xù)切片（冠狀切片），片厚20μm。間隔80μm的切片用以前已經(jīng)建立的方法做c-Fos和TH的免疫組化［1］。簡短地說，切片在 1%硼氫化鈉中孵育 20 min，10%山羊血清1 h。切片在兔抗c-Fos抗體 （c-Fos［4］-G：sc-52；1∶8 000；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）4℃孵育 24 h。之后，切片在生物素化的羊抗兔 IgG（BA-1000；1∶300；Vector，Burlingame，CA）室溫孵育2 h，抗生物素蛋白-生物素復合物（Vectastain Elite，Vector，Burlingame，CA）室溫 90 min，DAB（加入鎳粉）顯色。之后，切片在兔抗-TH（AB152；1∶8 000；Chemicon，Temecula，CA）室溫過夜，切片在生物素化的羊抗兔 IgG（BA-1000；1∶300；Vector，Burlingame，CA）室溫孵育 2 h，抗生物素蛋白-生物素復合物 （Vectastain Elite，Vector；Burlingame，CA）室溫90 min，DAB顯色。

1.2.5 圖像分析及統(tǒng)計學處理 每只小鼠各取3張不同斷面切片。并用imagine-pro-plus 6.0分析軟件在各腦區(qū)隨意選取三個視野，測量DA陽性神經(jīng)元胞體個數(shù)（反映DA相對含量）。計算每組切片單位面積內(nèi)DA陽性神經(jīng)元數(shù)目（平均密度）。

1.3 統(tǒng)計方法

采用 SPSS 17.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行數(shù)據(jù)分析。在統(tǒng)計分析前，所有數(shù)據(jù)用Kolmogorov-Smirnov和Levene分別進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。所有實驗數(shù)據(jù)組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；其中實驗 1的 Fos-ir，TH-ir和TH／Fos細胞的組間差異采用 t檢驗。結(jié)果用均數(shù) ±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 東莨菪堿對小鼠記憶的影響。

2.1.1 記憶行為 注射東莨菪堿明顯導致小鼠記憶受損。在測試記憶時（第 53天），SCOP 0.3、SCOP 3.0組和 NS組潛伏期（P＞0.05）和錯誤次數(shù)（P＞0.05）均無顯著差異；注射的第60天，注射東莨菪堿3.0 mg／kg組（SCOP 3.0）的潛伏期比 NS組顯著縮短，僅是 NS組的 1／4（P＜0.05），東莨菪堿 SCOP 3.0組錯誤次數(shù)比 NS組增加了大約 4倍（P＜0.05）。而注射東莨菪堿 SCOP 0.3mg／kg對小鼠記憶沒有作用（表1）。

Tab.1 Effect of different dose of scopolamine on dark avoidance behavior in mice（ˉx±s，n＝10）

2.1.2 腦中 Fos-ir和 TH-ir免疫陽性反應(yīng) 因為SCOP 0.3和 NS組記憶沒有差異，所以我們只將SCOP 3.0組動物處死后做腦組織的免疫組化研究。在伏隔核和海馬區(qū)的CA1和CA3的Fos-ir細胞數(shù)明顯減少（P＜0.01），暗示海馬區(qū) CA1和 CA3區(qū)的活性被抑制。而且與NS組相比，腹側(cè)被蓋區(qū)的TH-ir（P＜0.01）細胞減少了 38.3%，表明多巴胺神經(jīng)細胞減少；TH／Fos-ir（P＜0.01）細胞減少了 48.6%，暗示有功能的多巴胺神經(jīng)元減少。然而，外側(cè)下丘腦的Fos-ir細胞數(shù)、和室旁核的 TH-ir、TH／Fos-ir細胞和Fos-ir細胞均沒有檢測到差異（P＞0.05，表 2，圖 1）。

Tab.2 Scopolamine treatment decreased number of Fos-ir，TH-ir and Fos／TH-ir cells compared with saline treatment in mice（ˉx±s，n＝10）

Fig.1 Photomicrographs displaying cells labeled for Fos-ir（blackunctuate nuclear staining）or TH in the NAcc or VTA（A）PVN or LH（B），CA1 and CA3（C）

2.2 多巴胺激動劑阿樸嗎啡對東莨菪堿誘導的小鼠記憶的影響。

注射阿樸嗎啡明顯減輕了東莨菪堿誘導的記憶障礙。除了注射0.1 mg／kg對小鼠的記憶沒有任何作用外，注射 0.5 mg／kg和 2.0 mg／kg劑量均減輕了東莨菪堿誘導的記憶障礙（P＜0.05）。與NS組相比，錯誤次數(shù)分別減少了65.5%和75.0%；而潛伏期分別增加了1.5倍和1.44倍。且沒有劑量依賴性（P＞0.05，表 3）。

因為APO 0.5和APO 2.0組沒有差異所以合并為一組，做免疫組化。注射阿樸嗎啡后，小鼠伏隔核和海馬CA1區(qū)的活性明顯增加，具體表現(xiàn)為與NS組相比，伏隔核的 Fos-ir細胞數(shù)（P＜0.05）增加了69.6%，海馬的 CA1區(qū) Fos-ir細胞數(shù)（P＜0.05）增加了40.9%；腹側(cè)被蓋區(qū)的TH／Fos-ir共表達的細胞數(shù)（P＜0.05）比 NS組增加了46.2%，表明有功能的多巴胺神經(jīng)元增加了。同時，室旁核的Fos-ir、TH-ir和TH／Fos-ir細胞和外側(cè)下丘腦的Fos-ir細胞沒有任何差異（表 4，圖 2）。

Tab.3 Effect of different dose apomorphine on Scopolamine-induced memory deficit in mice（ˉx±s，n＝10）

Tab.4 Apomorphine treatment increased number of Fos-ir，TH-ir and Fos／TH-ir cells compared with saline treatment in scopolamine-induced memory deficit mice（ˉx±s，n＝10）

3 討論

本研究結(jié)果表明東莨菪堿導致小鼠記憶障礙，注射東蒗宕堿的小鼠錯誤次數(shù)比對照組增加了大約4倍，潛伏期的時間則縮短了大約1／4，伏隔核和海馬區(qū)的CA1和CA3的Fos-ir細胞數(shù)減少，說明海馬區(qū)的東莨菪堿抑制小鼠海馬CA1和CA3區(qū)的活性，與Eldred等的報道一致［2-4］。同時，東蒗宕堿導致腹側(cè)被蓋區(qū)的TH-ir和TH／Fos-ir共表達細胞顯著減少，暗示多巴胺神經(jīng)元的減少與記憶有關(guān)。注射多巴胺激動劑阿樸嗎啡后明顯減輕了東莨菪堿誘導的小鼠記憶障礙，表現(xiàn)為潛伏期增加、錯誤次數(shù)減少；伏隔核和海馬CA1區(qū)活性增加，腹側(cè)被蓋區(qū)TH／Fos-ir共表達的細胞增多，表明多巴胺神經(jīng)元被激活。這些數(shù)據(jù)表明中腦多巴胺神經(jīng)元與東莨宕堿誘導的小鼠記憶障礙有關(guān)。

Fig.2 Photomicrographs displaying cells labeled for Fos-ir（blackunctuate nuclear staining）or TH in the NAcc or VTA（A），PVN or LH（B），CA1 and CA3（C）

中腦多巴胺系統(tǒng)控制許多行為［5，6］，例如獎賞行為、成癮和學習行為。研究發(fā)現(xiàn)精神興奮類藥物和大多數(shù)成癮藥物均能增強多巴胺信號，從而增強調(diào)控學習行為的多巴胺進程［7］。研究發(fā)現(xiàn)反復暴露在精神興奮類藥物，例如氟哌丁苯，會導致腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺神經(jīng)元的改變和伏隔核多巴胺突觸后膜的變化，這些改變會持續(xù)幾周或者幾個月［8，9］。本實驗發(fā)現(xiàn)東莨菪堿誘導的小鼠記憶障礙后不僅降低了腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量（TH-ir細胞數(shù)）和活性（TH／Fos-ir共表達的細胞數(shù)），也降低伏隔核和海馬區(qū)的活性（Fos-ir細胞數(shù)），暗示多巴胺數(shù)量和活性的減少與小鼠的記憶障礙有密切的關(guān)系。而注射成癮藥物多巴胺激動劑阿樸嗎啡后減輕了小鼠的記憶障礙，表現(xiàn)為進洞的潛伏期增加、錯誤次數(shù)減少。而且注射阿樸嗎啡后盡管沒有增加多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量，但是腹側(cè)被蓋區(qū)TH／Fos-ir共表達的細胞數(shù)明顯增多，說明激活中腦多巴胺神經(jīng)元明顯增加小鼠的記憶。證實了我們的假設(shè)即多巴胺神經(jīng)元的激活可以增加小鼠的記憶。但是本研究僅僅發(fā)現(xiàn)了中腦多巴胺神經(jīng)元與東莨菪堿誘導的小鼠記憶有關(guān)，還不能直接證明腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺神經(jīng)元直接調(diào)節(jié)小鼠的記憶。因此，下一步的研究將直接損傷腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺神經(jīng)元，驗證多巴胺神經(jīng)元調(diào)節(jié)記憶的作用。

總之，本研究證明了多巴胺受體激動劑阿樸嗎啡可以緩解東莨菪堿誘導的小鼠記憶障礙。東莨菪堿抑制小鼠海馬CA1和CA3區(qū)的活性。同時，東莨菪堿不僅導致被蓋腹側(cè)區(qū)的多巴胺神經(jīng)元減少而且也抑制了該區(qū)多巴胺神經(jīng)元的活性。而多巴胺受體激動劑阿樸嗎啡則通過激活海馬CA1區(qū)和伏隔核及腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺神經(jīng)元來緩解東莨菪堿誘導的小鼠記憶障礙。本研究將進一步了解調(diào)節(jié)記憶的機制，為治療與記憶相關(guān)的疾病探討新的新方法提供理論依據(jù)。

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