醒腦靜對顱腦創(chuàng)傷的保護作用*

涂 悅，楊細平，商崇智

（1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，天津300162；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是神經(jīng)外科常見病，是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者死亡、殘疾的主要原因之一，病死率高達30%～50%［1］。目前對于顱腦損傷的治療包括一般治療、手術(shù)治療、藥物治療、高壓氧治療和亞低溫治療等等。醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上改制而成的水溶性注射液，廣泛應(yīng)用于臨床腦血管系統(tǒng)疾病的治療中。因為是中藥，國外對醒腦靜的研究很少，國內(nèi)對醒腦靜的研究主要側(cè)重于醒腦靜注射液對顱腦損傷患者的促醒作用。而本研究采用Feeney’s自由落體法制備大鼠TBI模型，通過檢測其腦內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD））、丙二醛（（malondialdehyde，MDA））含量及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性、腦含水量及S-100B蛋白和神經(jīng)特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）水平，對大鼠神經(jīng)功能缺損進行評分，旨在探討醒腦靜對顱腦損傷的保護作用及其可能機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材

主要試劑：MDA、SOD、GSH-Px測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），血清S-100B蛋白試劑盒（第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室），NSE試劑盒（瑞典Can Ag Diagnostics AB公司），醒腦靜注射液（無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司）。儀器：自制自由落體打擊裝置（擊錘、撞桿、打擊支架）；牙科鉆（寧波醫(yī)療器械廠）；S658型號電熱恒溫水浴箱（溫州永強醫(yī)療器械廠）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DDL-5型離心機（上海安亭科學(xué)儀器設(shè)備廠）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實驗動物及分組

成年健康清潔級雄性SD大鼠63只，體重（280～300）g，由天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，隨機分為3組（n＝21）：假手術(shù)組、模型組、醒腦靜組。每組又分3個亞組（n＝7），每個亞組，7只用于血清 S-100B蛋白和NSE水平測定，7只用于神經(jīng)功能評分及腦含水量測定，7只用于測定大鼠血清中SOD、NDA和GSH-Px含量。

1.3 大鼠TBI模型的建立

采用參照 Feeney’s自由落體模型設(shè)計［2］制作TBI模型。將大鼠用 10%的水合氯醛（0.35 g／kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，俯臥位置于平臺上，固定頭部。消毒后，沿右側(cè)顱頂旁正中切口，分離骨膜，用牙科鉆在前囪后1.5 mm，中線旁2 mm處鉆一直徑約4 mm的骨窗，保持硬腦膜完整，將撞桿頭端置于骨窗硬膜外，用20 g重的擊錘從30 cm高處自由墜落沖擊撞桿，撞擊能量為0.006 J，造成顱腦損傷，制作大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型。假手術(shù)組僅行開顱術(shù)，不造成腦損傷。醒腦靜組在大鼠顱腦損傷模型制好后10 min內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射醒腦靜注射液 10 ml／（kg·d），模型組與假手術(shù)組則經(jīng)尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液，三組均連續(xù)給藥7 d。

1.4 神經(jīng)功能缺損評分

三組大鼠于給藥第7天進行神經(jīng)功能缺損評分，評分量表包括3個方面，即運動試驗（提尾時大鼠前肢屈曲、后肢屈曲、頭部在30 s內(nèi)偏離垂直軸＞100°分別評為1分；將大鼠放于地板上，大鼠正常行走評0分，不能直線行走評1分，向輕癱側(cè)轉(zhuǎn)圈評2分，向輕癱側(cè)傾倒評3分）、感覺試驗（放置試驗1分，本體感覺試驗1分，平衡木試驗根據(jù)輕重程度分為0-6分）、反射喪失和不正常運動（耳廓反射，角膜反射，驚恐反射，癲病、肌陣攣、肌張力障礙各占1分），最低為0分，最高為18分，其中0～6分為輕度損害、7～12分為中度損害、13～18分為重度損害。

1.5 腦組織含水量測定

將大鼠斷頭處死，以損傷灶為中心取出約6 mm3的腦組織，分別置于預(yù)先稱好質(zhì)量的容器內(nèi)，用電子天平稱重。然后放入110℃干燥箱烘烤48 h至恒重，采用同樣方法稱取烘干后腦組織質(zhì)量，根據(jù)干濕質(zhì)量法［3］計算腦組織含水率，計算公式：（濕質(zhì)量－干質(zhì)量）／濕質(zhì)量×100%。

1.6 腦組織SOD、MDA和GSH-PX含量的測定

將大鼠用60 ml預(yù)冷的人工腦脊液（mACSF）快速心臟灌流后斷頭取腦，精確稱重后制備成10%的腦勻漿，4℃ 3 000 r／min離心 10 min后，取上清液-70℃保存用于檢測標(biāo)本。SOD用黃嘌呤氧化酶法測定，MDA用硫代巴比妥酸法測定，GSH-Px活性用比色法測定，均嚴格按試劑盒操作程序進行。

1.7 血清 S100B蛋白和 NSE水平測定

將各組斷頭取血3 ml，血標(biāo)本于3 000 r／min離心3 min后，取血清置-20℃冰箱保存，離心后取上清液0.5 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗 （ELISA）法檢測血清中S-100B蛋白和NSE含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能評分和腦含水量比較

與假手術(shù)組比較，醒腦靜組與模型組有明顯的神經(jīng)缺損，腦組織含水量明顯增加（P＜0.01，表1）；與模型組比較，醒腦靜組神經(jīng)缺損程度及腦含水量明顯低于模型組（P＜0.01）。實驗結(jié)果說明顱腦損傷可造成大鼠神經(jīng)功能缺損、增加腦含水量，引起腦水腫，醒腦靜治療7 d后可減輕大鼠神經(jīng)功能缺損程度，降低腦含水量。

2.2 顱腦損傷大鼠血清SOD、NDA和GSH-Px比較

與假手術(shù)組比較，醒腦靜組與模型組SOD、GSHPx含量明顯降低，MDA含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，血清中MDA升高水平明顯低于模型組，SOD、GSH-Px降低程度明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。

Tab.1 Changes of neural function score and cerebral water content in rats after traumatic brain injury（ˉx±s，n＝7）

Tab.2 Levels of MDA，SODand GSH-Px in the serum of rats（ˉx±s，n＝7）

2.3 顱腦損傷大鼠腦血清S-100B和NSE比較

與假手術(shù)組比較，醒腦靜組與模型組S-100B蛋白和NSE水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，醒腦靜組NSE蛋白水平明顯降低（P＜0.01，表3）。

Tab.3 Contents of S-100B and NSE in the serum of rats（μg／L，ˉx±s，n＝7）

3 討論

顱腦損傷后會產(chǎn)生大量自由基，自由基在腦外傷后的繼發(fā)性腦損傷中扮演極其重要的作用，它主要產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細胞和腦細胞，損害核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，引起血管源性腦水腫和細胞死亡。因此增強機體抗氧化能力，有助于預(yù)防繼發(fā)性腦損傷、促進受損腦組織康復(fù)［4］。S-100B是一種腦特異性蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，由星形膠質(zhì)細胞合成和分泌［5］。主要功能包括：（1）在生理濃度下，S-100B具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，高濃度的S-100B具有神經(jīng)毒性作用。（2）能夠營養(yǎng)5-羥色胺神經(jīng)元，同時又受到5-羥色胺負反饋的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控神經(jīng)細胞的能量代謝過程。（3）參與細胞內(nèi)外鈣離子水平的調(diào)節(jié)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。（4）增強三磷酸腺苷酶的活性。NSE屬于糖酵解同工酶二聚體，在神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)中濃度較高，顱腦損傷時血清中NSE含量會升高，目前研究認為NSE含量升高的主要原因是損傷導(dǎo)致神經(jīng)元細胞膜功能與結(jié)構(gòu)受損，NSE從神經(jīng)元胞漿中釋放出來，進入腦脊液和細胞間隙中，透過破損的血腦屏障NSE進入血液循環(huán)。因此，血清S-100B和NSE與腦損傷的嚴重程度密切相關(guān)［6］，具有較高特異性和敏感性，對腦損傷的診斷及傷勢的評估具有重要的臨床價值。

醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上改制而成的水溶性注射液，主要由麝香、石菖蒲、郁金、藿香、冰片等成分組成，具有醒神止痙、活血化瘀、清熱解毒的作用。有研究表明，醒腦靜注射液具有降低毛細血管通透性、減輕腦水腫、清除自由基等作用，可以在分子水平上進行腦保護［7］。本研究結(jié)果顯示醒腦靜注射液對顱腦損傷具有保護作用。研究表明麝香的有效成分是麝香酮，它可以減輕腦缺血大鼠超微結(jié)構(gòu)的損傷和降低神經(jīng)功能缺損程度［8］；石菖蒲提取液可以降低腦損傷大鼠的腦含水量，減輕腦水腫［9］；石菖蒲、冰片合用可以抑制顱腦損傷后腦內(nèi)細胞黏附分子-1的表達，減輕腦組織的炎癥反應(yīng)、外傷性腦水腫和神經(jīng)細胞缺氧性損傷［10］。

本實驗采用Feeney’s法制作大鼠TBI模型，具有損傷方法簡便，條件易于控制，損傷程度較一致等特點［11］。通過測定醒腦靜組與對照組腦組織含水量、自由基水平（SOD、NDA和 GSH-Px）及神經(jīng)特異性烯醇化酶（NSE）、S-100B蛋白水平，觀察大鼠神經(jīng)缺損程度來判定醒腦靜對顱腦損傷的療效。結(jié)果表明醒腦靜治療7 d后可減輕大鼠神經(jīng)功能缺損程度，減少腦組織含水量，增強SOD和GSH-Px活性，減輕氧自由基和脂質(zhì)過氧化物對神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示醒腦靜注射液對大鼠顱腦損傷具有保護作用，其作用機制可能與減輕顱腦損傷后腦水腫及抑制氧自由基反應(yīng)、保護神經(jīng)細胞有關(guān)，為臨床用藥提供了理論依據(jù)。

［1］ Arango-Lasprilla JC，Ketchum JM，Gfu D，et al.Predictors of extended rehabilitation length of stay after traumatic brain injury［J］.Arch Phys Med Rehabil，2010，91（10）：1495-1504.

［2］ Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to cortical injury：1.Methodology and local effects of contustions in the rat［J］.Brain Res，1981，211（1）：67-77.

［3］ Kouzounias K，Kimiskidis VK，Siozos T，et al.Topiramate promotes neurological recovery in a new model of traumatic brain injury in rats［J］.Neurosci，2011，183：171-177.

［4］ 季建平.超氧化物歧化酶微量快速測定法［J］.南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1991，10（3）：197.

［5］ 張祥根，姜正林，王國華，等.高壓氧治療創(chuàng)傷性腦損傷的效用及機制研究［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2012，28（1）：42-46.

［6］ 廖創(chuàng)新，王海軍.甲基強的松龍對腦損傷大鼠血清神經(jīng)組織蛋白 S100和神經(jīng)元特異性烯醇化酶的影響［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2004，20（11）：671-673.

［7］ 劉衛(wèi)平，易聲禹，章 翔，等.大鼠急性顱腦損傷早期微血管改變的形態(tài)學(xué)研究［J］.中華神經(jīng)外科雜志，1996，12（1）：46.

［8］ 梁 輝，陳 虎，高 穎，等.麝香酮抗局灶性腦缺血損傷的實驗研究 ［J］.中成藥，2003，25（3）：225-227.

［9］ 方永奇，李 翎，鄒衍衍，等.石菖蒲對缺血-再灌注腦損傷大鼠腦電圖和腦水腫的影響 ［J］.中國中醫(yī)急癥，2003，12（1）：55-56.

［10］蔣紅蘭，匡忠生，李 翎，等.石菖蒲冰片對神經(jīng)細胞缺氧性損傷的保護作用 ［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20（1）：63-65.

［11］李建偉，楊東軍，陳旭義，等.奧拉西坦對顱腦損傷大鼠的保護作用［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29（4）：298-300.