冷暴露小鼠尾動(dòng)脈舒縮功能變化以及血管活性藥物的作用特征*

韓文志，寧 萌，黃景慧，劉 衛(wèi)，張雁芳，崔文玉，汪 海

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所心血管藥物研究中心，北京100850）

在冷暴露過(guò)程中，機(jī)體通過(guò)釋放去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、神經(jīng)肽 Y（neuropeptide Y）等血管活性物質(zhì)誘發(fā)體表及肢端血管發(fā)生收縮反應(yīng)，減少外周供血，維持體心溫度［1，2］。此類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)引起的血管收縮及血管內(nèi)皮細(xì)胞冷損傷誘發(fā)形成的血栓是導(dǎo)致外周血液循環(huán)障礙和冷暴露過(guò)程中組織壞死的重要原因。因此，研究低溫條件下血管活性變化，改善肢端血液循環(huán)，保護(hù)血管內(nèi)皮避免低溫?fù)p傷對(duì)于預(yù)防凍傷發(fā)生、提高人體耐寒能力具有重要意義［3］。

早期研究發(fā)現(xiàn)，妥拉蘇林（tolazoline，Tol）合并山莨菪堿（anisodamine，Ani）能夠發(fā)揮擴(kuò)張末梢血管、改善微循環(huán)的作用，可以顯著提高冷暴露條件下的人體肢端溫度［4］。但由于Tol能夠非特異性阻斷突觸前膜α2受體易引發(fā)心動(dòng)過(guò)速、直立性低血壓等不良反應(yīng)［5］，經(jīng)我室前期對(duì)現(xiàn)有臨床常用特異性α1受體阻斷藥進(jìn)行篩選比較，從哌唑嗪（prasozin，PZ）、特拉唑嗪（terazosin）、多沙唑嗪（doxazosin）中選取擴(kuò)血管作用最強(qiáng)的PZ作為替代藥物與Ani聯(lián)合使用，并對(duì)其作用效果進(jìn)行了進(jìn)一步的藥效評(píng)價(jià)。維生素E（Vitamin E，Vit E）作為氧自由基清除劑可用于對(duì)抗低溫誘發(fā)局部組織缺氧引起的血管內(nèi)皮損傷，自身對(duì)血管舒縮功能無(wú)明顯影響［6］。上述藥物作為臨床用藥已被廣泛使用，但其在低溫條件下血管組織水平的作用特征尚未見(jiàn)報(bào)道，本文通過(guò)觀察冷暴露下的血管活性變化及上述藥物在低溫條件下對(duì)肢端血管活性的影響，為臨床應(yīng)用口服防凍效應(yīng)藥物提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Vit E、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、苯腎上腺素（phenylephrine，PE）、硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；PZ購(gòu)自日本 TCI公司。Krebs ringer液（mmol／L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl22.5，KH2P041.2，NaHCO325.0，MgS041.2，EDTA 0.026，Glucose 11.1。

1.2 小鼠尾動(dòng)脈血管環(huán)的制備

本實(shí)驗(yàn)采用雄性昆明小鼠，體重30～40 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。將小鼠斷頸處死后在鼠尾根部環(huán)切，扯下鼠尾的表面皮膚，分離尾腹側(cè)面動(dòng)脈血管，置于4℃的Krebs ringer液中，在鏡下小心去除血管周?chē)尺B的脂肪及結(jié)締組織，剪成約2 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛加有Krebs液的張力測(cè)定儀（DMT multi wire myograph system Model 610M）通道浴槽中，浴槽內(nèi)液體溫度依實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行調(diào)整，持續(xù)通入95%O2＋5%CO2的混合氣體，使用 Powerlab生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)記錄血管張力變化。調(diào)節(jié)血管張力預(yù)負(fù)荷至2 mN，每隔15 min換液1次，平衡1 h后，加入 80 mmol／L KCl收縮血管，重復(fù)三次，激發(fā)血管活性。以 PE（10-6mol／L）收縮血管待張力穩(wěn)定后，累積加入待測(cè)藥物記錄血管張力變化情況。

1.3 血管收縮反應(yīng)評(píng)價(jià)

選取活性良好的血管環(huán)，經(jīng)KCl預(yù)收縮并洗脫處理，待張力值穩(wěn)定后將其置于設(shè)定溫度條件下。待達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，累積加入 0.1、0.5、1、5、10、50 μmol／L的PE，記錄血管張力變化情況。以血管張力值為縱坐標(biāo)繪制濃度-效應(yīng)曲線。

1.4 血管舒張反應(yīng)評(píng)價(jià)

選取活性良好的血管環(huán)，經(jīng)預(yù)處理后置于設(shè)定溫度條件下，待血管張力值穩(wěn)定后加入10-6mol／L PE（PZ組使用 30 mmol／L KCl）收縮血管，分別累積加入不同的擴(kuò)血管藥物，記錄張力變化情況。以PE或KCl誘發(fā)的最大收縮為100%，以加人藥物后的血管張力幅度與PE誘發(fā)最大收縮幅度之間的比值作為舒張率反映血管張力的變化。采用血管舒張率為縱坐標(biāo)繪制濃度-效應(yīng)曲線。

1.5 Vit E低溫條件下對(duì)血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的影響

選取活性良好的血管環(huán)，分別加入Vit E至終濃度為 1μmol／L、10μmol／L，并將其置于 8℃低溫條件下孵育。加入PE使血管收縮，待收縮穩(wěn)定后累積加入 ACh（10-10～10-4mol／L），檢測(cè)血管對(duì) ACh的舒張反應(yīng)，對(duì)比無(wú)Vit E添加時(shí)8℃和37℃時(shí)的血管舒張反應(yīng)，評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同溫度條件下的血管舒縮功能變化特征

苯腎上腺素（phenylephrine，PE）能夠特異性激活α1受體誘發(fā)血管收縮，在不同溫度條件下依濃度梯度累積加入PE，低溫條件下的血管張力變化與37℃時(shí)相比明顯降低（P＜0.01，圖 1A）。37℃、25℃、16℃、8℃下的血管最大收縮張力分別可達(dá)到（30.14±0.68）mN、（20.18±1.39）mN、（16.16±1.00）mN、（9.10±0.32）mN。表明血管收縮具有一定溫度依賴性，隨著溫度的降低，血管收縮減弱。

SNP作為NO供體可以直接作用于血管平滑肌呈濃度依賴地誘發(fā)血管舒張，其作用不經(jīng)過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞。不同溫度條件下經(jīng)相同濃度PE收縮的血管在SNP作用下的血管舒張存在顯著差異（P＜0.01，圖1B）。隨著溫度的降低，SNP作用下的血管最大舒張率增大，量效曲線明顯左移，pD2依次為10.40±0.05、9.70±0.04、8.98±0.09、8.28±0.07。提示隨著溫度的降低，SNP作用下的血管舒張反應(yīng)增強(qiáng)。

2.2 不同溫度條件下 PZ、Ani擴(kuò)血管作用變化特征

PZ為α1受體阻斷劑，能夠引起 KCl（30 mmol／L）預(yù)收縮的小鼠尾動(dòng)脈環(huán)發(fā)生濃度依賴性舒張反應(yīng)，與37℃條件下時(shí)相比，低溫可明顯提高PZ的擴(kuò)張血管作用（P＜0.01，圖 2A），其中 PZ為 10-11mol／L時(shí)兩組的血管舒張率分別為（5.63±1.26）%和（35.12±3.14）%，PZ濃 度 為 10-5mol／L時(shí) 為（51.37±8.53）% 和（96.48±0.89）%。Ani為阿托品類(lèi)的生物堿，主要通過(guò)阻斷血管平滑肌細(xì)胞上的M1和M3受體發(fā)揮擴(kuò)血管作用，但同時(shí)也有報(bào)道指出其作用具有一定內(nèi)皮依賴性。低溫同樣能夠增強(qiáng)Ani的擴(kuò)血管作用（P＜0.01），其量效曲線存在明顯左移（圖2B），37℃和 8℃時(shí)相比 Emax分別為（74.88±1.76）%、（84.76±1.48）%，pD2分別為 9.77±0.06、9.49±0.06。提示上述兩種藥物在寒冷條件下對(duì)于肢端等低體溫部位的血管擴(kuò)張作用更強(qiáng)。

Fig.1 Effects of temperature on the vasoconstriction and vasodilatation in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）

2.3 不同溫度條件下ACh擴(kuò)血管作用變化特征

ACh可誘發(fā)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)發(fā)生濃度依賴性舒張，降低外界溫度可不同程度地抑制血管對(duì) ACh的舒張反應(yīng)。與 37℃組相比，25℃、16℃、8℃下血管舒張 Emax均顯著降低（P＜0.01，圖3），分別為（67.98±0.88）%、（56.73±0.92）%、（46.91±0.80）%、（46.29±0.67）%。結(jié)合 SNP不同溫度條件下的舒血管作用特征，提示低溫條件下ACh舒血管作用的減弱是由于內(nèi)皮細(xì)胞功能受損引起，表明低溫會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

2.4 低溫條件下Vit E的內(nèi)皮保護(hù)作用

Fig.2 Effects of drugs on the relaxation in different temperature in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）

低溫可造成血管內(nèi)皮細(xì)胞活性降低，致使ACh內(nèi)皮依賴的舒血管反應(yīng)減弱。在Vit E存在的情況下，低溫條件下ACh濃度依賴的舒血管反應(yīng)較對(duì)照組出現(xiàn)明顯改善，且10μmol／L的Vit E處理組血管舒張率高于 1μmol／L處理組（P＜0.01，圖 4A），提示Vit E具有一定的內(nèi)皮保護(hù)作用，且此作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。

Fig.3 Effects of acetylcholine on the relaxation in different temperature in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）Ach：Acetylcholine

Fig.4 Effect of the addition of Vit Eduring the cold injury on endothelium-dependent relaxation in mice caudal arterial rings（ˉx±s，n＝8）

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是對(duì)寒冷最敏感的部分，由于血管壁的損傷，血管壁的通透性增強(qiáng)，大量血管內(nèi)液體和蛋白質(zhì)外滲，形成滲出液和組織水腫，血液黏稠度大大增加，血流減慢，血液中有形成分堆積。加之血管壁受損后變粗糙，血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，使膠原纖維暴露，容易使血小板黏著和聚集成為血栓。此外，為維持體心溫度減少外周循環(huán)散熱，機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)促使外周血管收縮，導(dǎo)致外周組織缺氧、酸中毒及血液粘度的改變。該過(guò)程又進(jìn)一步誘發(fā)PGF1α、TXA2等細(xì)胞活性物質(zhì)的釋放，加劇血管進(jìn)一步收縮及血栓的形成［7］。當(dāng)機(jī)體無(wú)法快速?gòu)?fù)溫逆轉(zhuǎn)上述改變時(shí)，會(huì)由于炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加速凍傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程，最終導(dǎo)致無(wú)法逆轉(zhuǎn)的病理性損傷。因此，在短時(shí)間冷暴露情況下通過(guò)擴(kuò)張外周血管、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善微循環(huán)對(duì)于減輕或延緩上述病理過(guò)程、減少凍傷發(fā)生有著積極意義。

早期研究發(fā)現(xiàn)，Tol合并Ani在不增加熱債、不降低體心溫度的同時(shí)能夠持續(xù)提高肢端溫度，使肢端免于或延緩凍結(jié)［4］。其中Ani主要通過(guò)阻斷血管平滑肌細(xì)胞上的M1和M3受體引起血管舒張，可以明顯、快速緩解內(nèi)臟平滑肌痙攣和血管痙攣，提高細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠明顯降低血管收縮能力，低溫條件下的血管更易于舒張，提示冷暴露引起的外周血管收縮更易于被藥物所拮抗。PZ、Ani在較低溫度下均表現(xiàn)出優(yōu)于37℃條件下的擴(kuò)血管作用，推測(cè)此類(lèi)藥物作為預(yù)防藥物服用時(shí)對(duì)正常體溫下的血液循環(huán)影響較小，當(dāng)體表溫度降低時(shí)能有效擴(kuò)張外周血管，改善微循環(huán)。而PZ作為特異性α1受體阻斷藥用于替代Tol拮抗去甲腎上腺素的縮血管作用，在有效擴(kuò)張外周血管的同時(shí)有利于減少因阻斷α2受體所誘發(fā)的副反應(yīng)。

Vit E是機(jī)體中重要的抗氧化劑，與生物膜中的磷脂有著特殊的親和性，能夠通過(guò)抑制活性氧簇離子的形成，預(yù)防或阻止其誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并以此保護(hù)細(xì)胞在低溫條件下免受氧自由基的損傷［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫會(huì)引起ACh內(nèi)皮依賴的擴(kuò)血管作用的減弱，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管舒張的調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)一定損傷。使用不同濃度Vit E孵育血管能夠明顯增強(qiáng)低溫條件下血管內(nèi)皮依賴的舒張作用，提示Vit E可以保護(hù)內(nèi)皮避免低溫?fù)p傷，且該作用在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。Vit E在低溫條件下對(duì)血管的內(nèi)皮保護(hù)作用明顯，可適當(dāng)增加Vit E的攝入將有利于減少外周循環(huán)的內(nèi)皮損傷，改善組織供血，減少凍傷發(fā)生。

綜上所述，冷暴露過(guò)程中血管舒縮功能和內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用均有改變，血管收縮能力減弱，PZ、Ani此類(lèi)具有直接平滑肌作用的擴(kuò)血管藥物在低溫條件下的作用效果更強(qiáng)；同時(shí)Vit E在低溫條件下具有良好的內(nèi)皮保護(hù)作用，可以改善ACh內(nèi)皮依賴的擴(kuò)血管作用。外周供血不足和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損直接導(dǎo)致了冷損傷的發(fā)生發(fā)展，因此通過(guò)擴(kuò)張外周血管、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)具有積極意義。此外，由于擴(kuò)血管藥物低溫條件下的作用有所增強(qiáng)，也提示其作為預(yù)防藥物出現(xiàn)時(shí)的良好應(yīng)用前景。

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