17β-雌二醇及其受體調(diào)節(jié)劑對去卵巢大鼠子宮鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白表達(dá)的影響*

都中蕊，李紅芳，△，張 偉，田治峰，邱小青，盧研宇，梁乾坤，汪龍德

（1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，3.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，蘭州730000）

針對治療絕經(jīng)期綜合征的雌激素替代療法目前存在許多爭議，不當(dāng)使用雌激素可能導(dǎo)致宮頸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等疾病的發(fā)病率增加［1-3］，對雌激素的研究和應(yīng)用還有待于進一步深入。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可改變黏附連接分子復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，進而影響細(xì)胞間的黏附以及血管通透性［4］。在該復(fù)合體結(jié)構(gòu)中，鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-連環(huán)蛋白（α-catenin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是三種重要的黏附連接蛋白，通過其相互作用使相鄰細(xì)胞緊密連接在一起［5］。體內(nèi)雌激素異常而誘發(fā)雌激素依賴性腫瘤的發(fā)病機制可能與上述黏附連接復(fù)合體有關(guān)，但目前對雌激素引起鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白表達(dá)變化的機制尚未完全闡明，因此本實驗主要目的是研究Est對子宮鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白表達(dá)的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

17β-雌二醇、他莫昔芬均購自 Sigma公司，α-catenin、βcatenin及內(nèi)參β-actin的單克隆抗體均購自Santa Cruz公司，E-cadherin單克隆抗體購自博奧森公司，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 動物分組

選用12周左右健康雌性SD大鼠42只，體重200～230 g，隨機分為7組（n＝6）。麻醉后摘除雙側(cè)卵巢。實驗分組設(shè)計為：假手術(shù)組（Sham）；卵巢切除組（Ovx）；17β-雌二醇低、中、高劑量組 （Ovx＋Est）：Est劑量分別為 0.01 mg／kg、0.1 mg／kg、1.0 mg／kg；17β-雌二醇中、高劑量 ＋他莫昔芬組（Ovx＋Est＋Tam）；Est劑量分別為 0.1 mg／kg、1.0 mg／kg，Tam劑量為

30 .0 mg／kg；隔日皮下注射給藥，21 d后麻醉取子宮組織。

1.3 免疫組化SP法

將子宮組織石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)后，按照免疫組化SP試劑盒的說明進行實驗。免疫組化實驗共設(shè)8組，除上述7組外增加一組陰性對照組（即用 PBS替代一抗孵育），結(jié)果判斷：以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞，每例標(biāo)本選取5個高倍鏡視野進行陽性細(xì)胞計數(shù)：陽性細(xì)胞百分比小于5%為0分，5%～15%為1分，16%～30%為2分，31%～50%為3分，大于50%為4分。同時按著色強度計分：（1）0分：無染色，呈陰性；（2）1分：染色弱，呈淡黃色；（3）2分：染色中等，呈黃色；（4）3分：染色強，呈棕黃色。兩者積分乘積的高低決定陽性與否：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（＋）；5～8分為中度陽性（＋＋）；9～12分為強陽性（＋＋＋）。

1.4 Western blot法

提取子宮組織總蛋白，進行Western blot法檢測，經(jīng)過制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜后，進行封閉，再經(jīng)過一抗、二抗孵育，最后進行曝光顯影定影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 17β-雌二醇對鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，α-catenin、β-catenin和 E-cadherin三種蛋白在各實驗組中均有表達(dá)，主要定位于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿，β-catenin還有少量表達(dá)于細(xì)胞核。Sham組上述三種蛋白表達(dá)較低；Ovx組子宮萎縮明顯，三種蛋白的表達(dá)較Sham組顯著上調(diào)；與Ovx組相比，三種蛋白在Est中、高劑量組的表達(dá)均下調(diào)，Est低劑量組的表達(dá)與Ovx組無顯著差異（圖1，表1，圖1見彩圖頁Ⅲ）。

Western Blot法檢測α-catenin的表達(dá)與免疫組化結(jié)果一致（圖 2）。各組相對灰度值：Sham組0.15±0.008，Ovx組0.74±0.024，Ovx＋Est組 0.80±0.036，Ovx＋Est組 0.2±0.019，Ovx＋Est組 0.31±0.005（圖 2）。

2.2 選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑對雌二醇引起的鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達(dá)下調(diào)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，他莫昔芬對 Est（0.1 mg／kg）引起的α-catenin、β-catenin和 E-cadherin表達(dá)下調(diào)具有拮抗作用；而對Est（1.0mg／kg）引起的上述三種蛋白表達(dá)下調(diào)則表現(xiàn)出部分協(xié)同作用（圖1，表1，圖1見彩圖頁Ⅲ）。

Tab.1 Statistical analysis of the immunohistochemical staining results ofα-catenin andβ-catenin and E-cadherin in the uterus of rats in different groups（，n＝6）

Tab.1 Statistical analysis of the immunohistochemical staining results ofα-catenin andβ-catenin and E-cadherin in the uterus of rats in different groups（，n＝6）

Ovx：Ovariesctomy；Est：Estradiol；Tam：Tamoxifen**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs Ovx group

Group α-catenin β-catenin E-cadherin Sham 1.333±0.516 3.000±0.632 2.667±0.516 Ovx 10.000±1.549**11.333±1.633**12.000±0**Ovx＋Est 0.01 9.000±1.897**10.667±2.066**9.833±2.563**Ovx＋Est 0.1 1.500±0.548＃＃ 3.167±0.753＃＃ 2.000±0.894＃＃Ovx＋Est 1.0 6.000±1.265＃＃ 6.333±0.816＃＃ 6.333±2.251＃＃Ovx＋Est 0.1＋Tam 10.668±2.066**11.333±1.633**11.500±1.225**Ovx＋Est1.0＋Tam 2.000±0＃＃ 3.333±0.516＃＃ 2.500±0.548＃＃

Fig.2 Results of Western blot ofα-catenin andβ-actin proteins（A）and relative expression level ofα-catenin（B）in uterine tissue of ovariectomized rats

3 討論

鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白在維持血管通透性方面有重要作用［6］，血管通透性由穿細(xì)胞途徑和與黏附連接蛋白有關(guān)的細(xì)胞旁途徑所決定［7］。本實驗從Est影響細(xì)胞旁途徑的角度進行研究發(fā)現(xiàn)，鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白在Est中劑量組和假手術(shù)組子宮組織中的表達(dá)無顯著差異，且均表達(dá)較低，切除卵巢引起的內(nèi)源性雌激素缺乏會使其表達(dá)顯著增高，Est的干預(yù)可使去卵巢大鼠子宮鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白的表達(dá)下調(diào)，但無劑量效應(yīng)，推測其原因可能是由于血管通透性不僅與黏附連接分子的表達(dá)量有關(guān)，還與黏附連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，復(fù)合體結(jié)構(gòu)中鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白和細(xì)胞骨架的分離，會破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附聯(lián)接，引起血管通透性增加。此外，鈣黏蛋白和連環(huán)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞粘附，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密不可分，細(xì)胞間粘附力的下降有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)βcatenin還參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Est可激活該通路使細(xì)胞膜上β-catenin與E-cadherin分離，破壞細(xì)胞黏附連接，同時，游離在胞漿中的β-catenin進入細(xì)胞核，激活癌基因，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［8］。

他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，具有雙向調(diào)節(jié)作用，可與雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體而產(chǎn)生抗雌激素效應(yīng)，或激活雌激素受體而產(chǎn)生雌激素樣作用。我們推測，Tam可干預(yù)Est引起的鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達(dá)下調(diào)作用，故Est對鈣黏連蛋白和連環(huán)蛋白表達(dá)的影響機制可能與雌激素受體有關(guān)，Se-Hyung Park等［9］的研究也支持了這一結(jié)論。

通過研究Est對大鼠子宮鈣黏蛋白、連環(huán)蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)其作用機制與雌激素受體有關(guān)，有助于探索雌激素影響血管通透性和細(xì)胞黏附的機制，以及雌激素依賴性腫瘤的發(fā)病機制，為臨床腫瘤的防治提供依據(jù)，有利于人們找到新的腫瘤治療方法，同時也為他莫昔芬在雌激素替代療法中的運用提供依據(jù)，但由于雌激素在體內(nèi)的作用十分復(fù)雜，其機制還有待于深入研究。

［1］ Carico E，Atlante M，Bucci B，et al.E-cadherin andαcatenin expression during tumor progression of cervical carcinoma［J］.Gynecol Oncol，2001，80（2）：156-161.

［2］ Schairer C，Lubin J，Troisi R，et al.Menopausal estrogen and estrogen-progestin replacement therapy and breast cancer risk［J］.JAMA，2000，283（4）：485-491.

［3］ Rubin GL，Peterson HB，Lee NC，et al.Estrogen replacement therapy and the risk of endometrial cancer：Remaining controversies［J］.Am JObstet Gynecol，1990，162（1）：148-154.

［4］ Groten T，Pierce AA，Huen AC，et al.17β-estradiol transiently disrupts adherens junctions in endothelial cells［J］.FASEB J，2005，19（10）：1368-1370.

［5］ Ingber DE.Cell structure and hierarchical systems biology［J］.J Cell Sci，2003，116（Pt 7）：1157-1173.

［6］ 趙克森，黃巧冰.血管通透性增高的基本機制［J］.中國病理生理雜志，2003，19（4）：549-553.

［7］ Komarova Y，Malik AB.Regulation of endothelial permeability via paracellular and transcellular transport pathways［J］.Annu Rev Physiol，2010，72（3）：463-493.

［8］ Medrdk C，Landberg G，Andersson T，et al.WNT-5a-CKI α-signaling promotesβ-catenin／E-cadherin complex formation and intercellar adhesion in human breast epithelial cells［J］.Biol Chem，2009，284（16）：10968-10979.

［9］ Park SH，Cheurg LW，Wong AS，et al.Estrogen regulates Snail and Slug in the down-regulation of E-Cadherin and induces metastatic potential of ovarian cancer cells through estrogen receptor alpha［J］.Mol Endocrinol，2008，22（9）：2085-2098.