蛋白質(zhì)組學在肺癌研究中的應用

王 攀 李招云

（臺州市恩澤醫(yī)療（集團）中心醫(yī)院，浙江臺州 318000）

·綜述·

蛋白質(zhì)組學在肺癌研究中的應用

王 攀 李招云

（臺州市恩澤醫(yī)療（集團）中心醫(yī)院，浙江臺州 318000）

蛋白質(zhì)組學是指對機體、組織或細胞的全部蛋白質(zhì)的表達和功能模式的研究。目前用于蛋白質(zhì)研究的支撐手段主要有雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術等。肺癌是當前全球癌癥發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。通過對正常肺和肺癌的組織或血清或細胞的蛋白質(zhì)組研究，可以直接比較兩者之間蛋白質(zhì)組表達的差異，為肺癌的早期診斷、療效觀察及預后評價等提供指導。

蛋白質(zhì)組學；肺癌；質(zhì)譜技術

20世紀90年代新生了一門以蛋白質(zhì)組為研究對象，在整體水平上研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的一門新興學科——蛋白質(zhì)組學。蛋白質(zhì)組學（Proteomics）是作為功能基因組學的重要支柱，并已同基因組學（Genomics）和生物信息學（Bioinformatics）一起成為新世紀生命科學研究的前沿和熱門領域［1］。

原發(fā)性支氣管肺癌（Primary bronchogenic carcinoma）簡稱肺癌（Lung cancer），肺腫瘤細胞源于支氣管黏膜或腺體，常有區(qū)域性淋巴細胞結轉(zhuǎn)移和血性播散，早期常有刺激性咳嗽、痰中帶血等呼吸道癥狀。癌癥的發(fā)生是機體正常細胞在多因素、多基因作用下經(jīng)過多途徑發(fā)生轉(zhuǎn)化，不論是環(huán)境因素還是遺傳因素，最終都必須通過基因及相應蛋白質(zhì)的表達來發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)的豐度、結構或功能的改變不僅在患者出現(xiàn)臨床癥狀之前就已經(jīng)給出了重要的病理學異常的暗示，而且還是重要的診斷性和先兆性生物學標志［2］。所以直接從蛋白質(zhì)整體水平入手，分離和鑒定正常人與肺癌患者肺組織或血清或細胞中表達的蛋白質(zhì)、分析蛋白質(zhì)表達譜的差異，對研究肺癌發(fā)病機制、早期診斷、治療及預后具有重要意義。

1 蛋白質(zhì)組學的概念和研究內(nèi)容

蛋白質(zhì)組學的概念是由澳大利亞Macquarie大學的Williams和Wilkins等［3］于1994年首次提出，廣義上指的是一個給定的細胞、組織、器官或完整的生物體擁有的全部蛋白質(zhì)，是一個基因組內(nèi)所有基因表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學是以蛋白質(zhì)組為研究對象，以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)為研究基礎，在蛋白質(zhì)水平對疾病機理、細胞模式及功能聯(lián)系等方面進行探索的一門新興學科［4］。蛋白質(zhì)組學最有價值的優(yōu)勢是它可以觀察在特定的時間下一個完整的蛋白質(zhì)組或蛋白質(zhì)亞型在某種生理或病理狀態(tài)中發(fā)生的相應變化。

2 蛋白質(zhì)組學的相關技術

蛋白質(zhì)組學研究的首要任務是建立獲取和分析蛋白質(zhì)的常規(guī)、可靠、有效的技術平臺?，F(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的研究可分為3個主要步驟：（1）應用雙向凝膠電泳、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì)；（2）應用氨基酸組成分析、C－或N－末端氨基酸序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì)；（3）應用生物信息學數(shù)據(jù)庫對鑒定結果進行存儲、處理、對比和分析。

3 蛋白組學在肺癌中的應用

3.1 肺癌發(fā)生發(fā)展機制 沙慧芳等［5］應用DIGE和質(zhì)譜技術對肺癌患者和肺部炎癥患者、健康者之間血漿蛋白質(zhì)表達譜的差異進行研究。實驗結果共找到72個差異蛋白點，27個蛋白質(zhì)點被成功鑒定，其中7種已知與腫瘤密切相關：參與脂肪酸代謝途徑的ACSF3和可促進肺癌細胞生長的α和β－纖維蛋白在肺癌中上調(diào)；補體因子H和血清淀粉樣蛋白中的急性相蛋白A過表達；GPⅠb特異性抗體在肺癌中升高，估計與肺癌患者免疫系統(tǒng)被激活而使機體產(chǎn)生針對血小板膜糖蛋白自身抗原的特異性抗體有關。Pernemalm等［6］采用質(zhì)譜技術分析推測預后較差的肺腺癌患者有較高的糖酵解活性和HIF激活，以及在早期復發(fā)的肺腺癌患者中檢測出HIF1αmRNA過表達，認為在預后不良組的上調(diào)蛋白質(zhì)（組織蛋白酶D，ENO1和VDAC1）確實起源于腫瘤而非基質(zhì)或炎癥的部位，為進一步深入理解腫瘤發(fā)展機制提供了依據(jù)。

3.2 肺癌腫瘤標志物的篩選 改善肺癌患者預后的關鍵在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，而肺癌的早期診斷率僅15%～25%［7］。同時，研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者診斷的中位醫(yī)生延遲時間為1.3周（0.3～52.3周），29.1%的患者首次診斷時被誤診［8］。目前臨床上使用最多的腫瘤標志物為癌胚抗原和鱗狀上皮細胞癌抗原，但是靈敏性和特異性均不夠，因此有必要發(fā)現(xiàn)更具有針對性的肺癌標志物。劉丹等［9］運用MALDI－TOF－MS磁珠技術對正常人與肺腺癌患者的血清進行比較，發(fā)現(xiàn)6個差異蛋白峰，其中m／z為2661、2991的差異蛋白峰在肺腺癌組表達升高，m／z為4091、4210、4644、5336的差異蛋白峰在肺腺癌組表達降低。提示6個差異蛋白峰可能是肺腺癌患者潛在的腫瘤標志物。Lee等［10］采用2－DE和肽質(zhì)量指紋圖譜技術研究肺癌組織及鄰近正常組織的蛋白表達發(fā)現(xiàn)幾種差異表達蛋白，這些差異蛋白在肺癌組織中表達活性增強，如GRP78、GRP96、HSP27、GST、L－巖藻糖、β－肌動蛋白、微管蛋白β－2／3、膜聯(lián)蛋白A5／3、14－3－3θ等。Lee認為這些改變可以用于支持肺癌診斷的標志物。Jeong等［11］采用2－DE和MALDITOF技術分析小細胞肺癌組織和正常支氣管上皮細胞之間的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)7種蛋白（Y－肌動蛋白、α－ 1B微管蛋白、COTL－1、層粘連蛋白B1、泛素羧基末端酯酶L1、泛素結合酶E2－25以及碳酸酐酶1）在小細胞肺癌（SCLC）中表達上調(diào)2倍以上，特別是COTL－1可以看作是SCLC的腫瘤標記物和治療目標。Shevchenko等［12］對77例肺鱗癌和10例健康人血漿標本用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）進行分析研究，發(fā)現(xiàn)43種蛋白質(zhì)在肺腺癌中過度表達，其中某些蛋白質(zhì)高表達參與了腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，被認為可以用于支持肺癌診斷的標志物。Chaudhary等［13］對肺癌患者和健康人肺組織采用液相色譜－質(zhì)譜（LC－MS／MS）進行分析，結果顯示66種蛋白在癌組織中的過表達，經(jīng)鑒定得出三種蛋白，即過氧化物氧化還原酶－6，β－肌動蛋白和膠原蛋白α－1（VI）可以作為肺癌的早期診斷的潛在標志物。

3.3 輔助病理學分型 Chen等［14］對93例肺腺癌和10例正常肺組織標本用2－DE－PAGE和MALDITOF－MS技術進行研究，發(fā)現(xiàn)9種蛋白質(zhì)在肺腺癌中過度表達，其中某些蛋白質(zhì)高表達與特定的臨床病理變化密切相關。Yanagisawa等［15］采用MALDITOF－MS技術對79例肺癌、14例正常肺組織冰凍切片進行實驗，研究非小細胞肺癌的組織學分類、淋巴結轉(zhuǎn)移及預后的蛋白質(zhì)譜。實驗結果共識辨出1600個蛋白峰，并建立了一種用蛋白質(zhì)差異指紋網(wǎng)譜進行肺癌組織學分類的模型。使用該模型對42例肺癌和8例正常肺組織的樣本進行準確的組織學分類，區(qū)分原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤，對淋巴結受累區(qū)分的準確率達85%，利用這一模型在37例肺癌、6例正常肺組織的盲篩中也得到較高的準確率。

3.4 療效預測 手術根治仍是目前治療肺腺癌唯一有確切療效的方法，術后配合化療，其5年生存率可達15%～40%。隨著人們對聯(lián)合化療分子機制認識的不斷進展，發(fā)現(xiàn)一些腫瘤分子標志物的改變與化療敏感性有關，并且在肺癌預后方面也具有絕對的優(yōu)勢。Li等［16］用R－MVL作用于肺癌細胞A549后，采用質(zhì)譜技術分析差異蛋白，確定其中7種與A549凋亡相關蛋白，包括2種上調(diào)蛋白：β－肌動蛋白和醛脫氫酶1，以及5種下調(diào)蛋白：絲束蛋白3、原肌球蛋白3、熱休克蛋白90、熱休克蛋白30和β－微管蛋白。該研究成果為治療肺癌提供了潛在的靶點，同時促進抗癌治療策略的發(fā)展。Zeng等［17］通過2－DE與MALDITOF相結合，比較肺腺癌A549細胞和順鉑耐藥A549／DDP細胞之間蛋白質(zhì)的差異。結果顯示DJ－1的高表達與患者預后不良密切相關，提示DJ－1可以作為預測以順鉑為基礎化療患者的預后。Zhang等［18］采用iTRAQ標記結合2D LC－MS／MS分析原發(fā)性肺腺癌和癌旁正常肺組織差異蛋白質(zhì)的表達，結果顯示，脂閥結構蛋白－1的水平可以預測是肺腺癌的淋巴結轉(zhuǎn)移和預后的狀況。

3.5 肺癌蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)庫的完善 目前還沒有完全闡述已分離的差異蛋白的作用，但為今后進一步深入研究打下了基礎。美國密歇根大學醫(yī)學中心在NIH資助下應用蛋白組學方法對包括肺癌在內(nèi)的癌細胞和組織進行了大規(guī)模的研究，并著手建立肺癌蛋白表達數(shù)據(jù)庫［19］。

4 肺癌蛋白組學發(fā)展前景

隨著肺癌發(fā)病率的不斷上升，蛋白質(zhì)組學技術在肺癌中的應用成為國內(nèi)外研究的熱點之一，并且在發(fā)病機制、標記物選擇、療效預測等方面取得了一些成果。但目前技術中還存在許多問題，如：研究樣品用量大、重復性差、研究樣品中含有的多種成分對圖譜準確度分析產(chǎn)生干擾、蛋白質(zhì)分離技術難以滿足蛋白質(zhì)種類分離的要求以及難以實現(xiàn)自動化等，并且在研究中發(fā)現(xiàn)的腫瘤差異蛋白也缺乏臨床證據(jù)，不能完全應用于臨床。相信隨著科學技術的不斷進步，蛋白組學必將在肺癌的臨床應用中發(fā)揮越來越重要的作用。

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浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2011ZA114）