社區(qū)獲得性肺炎非典型病原體的診斷方法進(jìn)展

童春堂 陳杭薇

社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)是指在醫(yī)院外罹患的肺實(shí)質(zhì)感染性(含肺泡壁，即廣義上的肺間質(zhì))炎癥, 包括具有明確潛伏期的病原體感染，在入院后潛伏期內(nèi)發(fā)病的肺炎[1]。CAP嚴(yán)重威脅人類健康, 在世界不同的國(guó)家和地區(qū)有較高的發(fā)病率。引起CAP的主要病原體有細(xì)菌、病毒以及非典型病原體等，其中仍以肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌為代表的細(xì)菌較常見[2]。近年來(lái)隨著人口老齡化、病原譜改變、檢測(cè)方法的改進(jìn)及抗生素濫用等原因，肺炎鏈球菌的感染率有所下降, 而非典型病原體及病毒的感染率在逐年上升[3]，因而在 CAP 的診治方面除考慮細(xì)菌感染外，還需警惕包括肺炎支原體(mycoplasma pneumonia, MP)、肺炎衣原體(chlamydia pneumonia, CP)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila, LP)等在內(nèi)的非典型病原體所致CAP的可能，現(xiàn)就近年來(lái)引起CAP的非典型病原體診斷方法的進(jìn)展綜述如下。

一、非典型病原體在CAP中的地位

CAP的病原體主要有細(xì)菌、病毒以及非典型病原體，其中非典型病原體主要有MP、CP、LP等。以往認(rèn)為年輕CAP患者容易感染非典型病原體，但近年來(lái)的研究表明老年人中亦有一定比例的MP、LP、CP感染，且常常是混合感染[4]。過去因認(rèn)識(shí)不足及檢測(cè)方法的限制，非典型病原體在CAP中的作用被低估，隨著對(duì)呼吸道非典型病原體研究的深入，人們逐漸重視到其在呼吸道感染中的地位。2003年12月至2004年11月劉又寧等[5]對(duì)665例CAP患者進(jìn)行的多中心病原學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌與非典型病原體檢測(cè)的610例患者中，53.1%(324例)檢測(cè)到病原體，其中MP、CP、LP陽(yáng)性率為32.3%，MP陽(yáng)性率為20.7%(126例)，超過肺炎鏈球菌的10.3%(63例)，成為導(dǎo)致CAP最常見的病原體，2項(xiàng)及以上病原體混合感染率為11.5% (70例)，其中以細(xì)菌合并非典型病原體居多, 尤其是肺炎鏈球菌合并MP感染，195例細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性患者中10.2%(62例 )合并非典型病原體的感染。2007年進(jìn)行的一項(xiàng)全球CAP病原學(xué)調(diào)查分析結(jié)果顯示非典型病原體在北美、拉美、歐洲和亞非的發(fā)病率分別為28%、21%、22%和20%[1]。尤蘭華等[6]在2013年1月6日至2013年1月15日對(duì)北京周邊軍營(yíng)中403名出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咽痛、鼻塞、流涕等呼吸道癥狀的新兵中進(jìn)行的一項(xiàng)呼吸道病毒及非典型病原體IgM抗體調(diào)查結(jié)果顯示，MP、LP抗體陽(yáng)性率分別為13.9 % (56例)、 6.0%(24例)，2項(xiàng)及以上病原體IgM抗體混合陽(yáng)性率為5.5%(22例)，其中以MP合并LP最為常見。一些學(xué)者認(rèn)為包括MP、LP等在內(nèi)的呼吸道非典型病原體將來(lái)有可能取代肺炎鏈球菌成為引起CAP最重要的病原體[7]。

二、 CAP中非典型病原體的診斷

1.MP的診斷： MP是介于細(xì)菌和病毒之間的一種病原微生物，可引起氣管炎、支氣管炎、肺炎等, 并導(dǎo)致多種肺內(nèi)外并發(fā)癥，是引起CAP的常見病原微生物。一般起病隱匿，感染后潛伏期為2～3周，臨床癥狀缺乏特異性，常有發(fā)熱、咳嗽，可伴頭痛、乏力、肌痛等全身中毒癥狀[8]。血常規(guī)白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比例大多正常[9]，胸部X線表現(xiàn)為肺門部位模糊影，也可呈大片實(shí)變影，多累及上肺，病變吸收緩慢[10]，目前實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)方法等。

(1)分離培養(yǎng)法：MP的分離培養(yǎng)特異性高，是診斷MP感染的最為可靠的方法，但生長(zhǎng)緩慢，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基要求較高，一般選取鼻咽拭子、痰液標(biāo)本接種于液體或半固體培養(yǎng)基中。目前以SP-4肉湯培養(yǎng)基應(yīng)用最為廣泛，此種方法敏感性低，特異性卻很高[11]。此法存在部分患者干咳不易獲取標(biāo)本、標(biāo)本采集過程中易污染、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、費(fèi)用高等不足，難以滿足臨床快速早期病原診斷的要求，一般不作為臨床檢測(cè)方法，多用于科研[12]。 Thurman等[12]研制的MP快速液體培養(yǎng)基，通過采集鼻咽拭子，利用MP的代謝產(chǎn)物分解葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)基中pH值降低，通過指示劑顏色改變來(lái)間接判斷是否有MP的增殖，24～48 h內(nèi)觀察結(jié)果，該方法簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需特殊設(shè)備，適合臨床實(shí)驗(yàn)室診斷MP的感染[13]，其特異性在排除細(xì)菌或真菌等導(dǎo)致的假陽(yáng)性后可達(dá)到與血清學(xué)一致的水平[14]。

(2)血清學(xué)：血清學(xué)檢測(cè)是診斷MP感染的常規(guī)方法[15]，包括對(duì)抗原和抗體的檢測(cè)，目前臨床上多檢測(cè)MP的特異性IgM和IgG抗體。IgM一般在機(jī)體感染后7～10 d出現(xiàn)，是機(jī)體感染MP后最早出現(xiàn)的抗體。3～6周達(dá)到高峰后逐漸下降，血清中檢出IgM抗體常提示新近感染，而IgG抗體在機(jī)體感染后出現(xiàn)較晚，但存在時(shí)間長(zhǎng)，其濃度峰值出現(xiàn)在機(jī)體感染MP后的第5周[16]。急性感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)為急性期IgG抗體與間隔2～4周測(cè)定的恢復(fù)期IgG抗體滴度存在4倍及以上升高[17]，血清學(xué)常用的方法包括冷凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test, CFT)、間接血凝試驗(yàn)(indirect hemagglutination test, IHA)、間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence, IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等。其中①冷凝集試驗(yàn)：機(jī)體感染MP后發(fā)生非特異反應(yīng)產(chǎn)生冷凝集素，主要是IgM抗體，因嚴(yán)重貧血、流感病毒及腺病毒感染等也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，其特異性較低，但因其技術(shù)操作簡(jiǎn)單，在部分單位仍作為診斷MP感染的重要方法；②CFT：機(jī)體感染MP后7～8 d補(bǔ)體結(jié)合抗體開始上升,主要檢測(cè)特異性IgM抗體，初次感染時(shí)結(jié)果陽(yáng)性，再次感染時(shí)常常呈陰性[18]，因此陰性不能排除MP感染，且需要專業(yè)人員、操作復(fù)雜，不適于臨床常規(guī)檢測(cè)；③間接血凝試驗(yàn)：基于紅細(xì)胞表面的抗體(或抗原)與相應(yīng)抗原(或抗體)結(jié)合使紅細(xì)胞集聚發(fā)生凝集的原理，主要檢測(cè)IgM抗體，操作簡(jiǎn)便、快速，但是因其與生殖道支原體及LP存在交叉反應(yīng)，限制了其在臨床的推廣應(yīng)用[19]；④IFA: 可定性檢測(cè)MP的特異性IgM抗體，具有較高的敏感性和特異性,操作簡(jiǎn)便、不需特殊儀器、人員要求低，適合臨床實(shí)驗(yàn)室MP檢測(cè)的要求，能夠?yàn)榕R床提供早期診治的病原依據(jù)，是諸多快速檢測(cè)方法中值得推薦的一種技術(shù)[20]；⑤ELISA：是目前應(yīng)用最廣泛的血清學(xué)方法，可同時(shí)檢測(cè)MP特異性IgM和IgG抗體。有報(bào)道稱其檢測(cè)成人IgM靈敏性可達(dá)82%[12]，臨床中可聯(lián)合檢測(cè)IgM 和IgG抗體以提高診斷靈敏度，該方法快速、簡(jiǎn)便、特異性高，但靈敏感度低、費(fèi)用高。

(3)分子生物學(xué)法：主要包括核酸雜交技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)，以后者應(yīng)用更為廣泛。自Benmet于1989年首次將PCR技術(shù)應(yīng)用于MP的診斷[21]，PCR技術(shù)已不斷發(fā)展與成熟。PCR法對(duì)標(biāo)本的要求低，標(biāo)本來(lái)源可以為鼻咽拭子、痰液、胸腔積液等，即使標(biāo)本中存在微量的病原體，也能得到陽(yáng)性的結(jié)果，其檢測(cè)MP的DNA敏感性及特異性均較好[18]。采用特異標(biāo)記的探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在MP感染早期、血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)亦能獲得陽(yáng)性結(jié)果，適合2歲以下兒童感染患者[22]。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR) 可直接檢測(cè)標(biāo)本中的MP抗原，且MP-PCR拷貝數(shù)越大越支持MP感染的診斷[23]。但PCR法操作技術(shù)復(fù)雜、人員素質(zhì)要求高、設(shè)備昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室不易普及。

2.CP的診斷

CP為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，主要通過呼吸道傳播，人群普遍易感，其潛伏期為1～3個(gè)月，臨床表現(xiàn)不典型，常出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱、咽喉疼痛、聲音嘶啞等，可引起、支氣管炎、肺炎等[24]，胸部X線多表現(xiàn)為單側(cè)的片狀陰影和網(wǎng)狀浸潤(rùn)影[25]。CP感染與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死也有一定關(guān)系[26-27]，病原體檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、血清學(xué)和PCR法。

(1)分離培養(yǎng)法：CP只能生長(zhǎng)繁殖于活細(xì)胞內(nèi)，分離培養(yǎng)方法是診斷CP感染最可靠的方法，標(biāo)本可采用鼻咽拭子、胸腔積液或痰液，但操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不能為臨床診治提供早期快速的病原依據(jù)。

(2)血清學(xué)方法：CP感染潛伏期為1～3個(gè)月，機(jī)體多于感染CP后2～4周產(chǎn)生IgM抗體， IgG抗體產(chǎn)生則在第6～8周，通過測(cè)定IgG和IgM 抗體可區(qū)分急性和既往感染[28]。血清學(xué)方法包括CFT、ELISA、直接免疫熒光法(direct immunofluorescence, DIF)、間接微量免疫熒光法(micro-IF, MIF)等。其中:①CFT：因部分患者重復(fù)感染CP時(shí)可不出現(xiàn)補(bǔ)體結(jié)合抗體，導(dǎo)致補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性率低，限制其應(yīng)用；②ELISA：基于酶標(biāo)記的ELISA可同時(shí)檢測(cè)CP的IgM、IgG、IgA 抗體，該方法簡(jiǎn)便、快速，適于大樣本篩查, 但與某些細(xì)菌存在交叉抗體反應(yīng)；③DIF：以熒光標(biāo)記的抗CP單克隆抗體檢測(cè)其抗原，CP與其他衣原體屬、微生物如百日咳桿菌、大腸埃希桿菌等有交叉抗原成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果假陽(yáng)性率高，靈敏性及特異性低；④MIF是目前應(yīng)用最廣泛的血清學(xué)方法，是將待檢的標(biāo)本滴加在已知的抗原或抗體平板上，再加入熒光色素標(biāo)記的抗人球蛋白，于熒光顯微鏡下觀察的方法。該法敏感性高于直接熒光法，特異性高、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊儀器，是檢測(cè)感染經(jīng)典的金標(biāo)準(zhǔn)法[29]。

(3)PCR法：PCR方法于1992 年首次用于CP的診斷，根據(jù)CP特異性的抗原或基因片斷進(jìn)行檢測(cè), 能直接反映是否有活性的CP病原體存在[30]，其診斷CP感染敏感性和特異性均較高, 陽(yáng)性提示即時(shí)感染[31]。其中FQ-PCR檢測(cè)CP具有特異性高、準(zhǔn)確定量、降低交叉污染等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)CP感染早期診斷有重要意義[32]。PCR方法取材方便、無(wú)創(chuàng)傷易被接受，敏感性和特異性相對(duì)較高，值得在臨床應(yīng)用和推廣，不足的是操作要求高，且不同實(shí)驗(yàn)室采用不同的引物，無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化，尚未得到普遍認(rèn)可。

3.LP的診斷

LP是引起呼吸道感染的主要非典型病原體之一，在1976年美國(guó)費(fèi)城退伍軍人中首次被發(fā)現(xiàn)并命名。LP廣泛存在于自然界和空調(diào)、冷卻塔、淋浴器等供水系統(tǒng)中，機(jī)體可因吸入被LP污染的水源產(chǎn)生的氣溶膠感染[33]。目前已知16個(gè)血清型，其中LP1型是CAP最常見的病原體[34]，潛伏期為2～10 d，臨床癥狀主要有刺激性咳嗽、發(fā)熱、頭痛及全身不適等，易造成多器官損害，胸部X線可呈斑片、結(jié)節(jié)狀改變或間質(zhì)浸潤(rùn)影[35]。 其檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、PCR法、抗體和抗原檢測(cè)。

(1)分離培養(yǎng)：該方法為L(zhǎng)P臨床診斷及流行病調(diào)查的金標(biāo)準(zhǔn)，但LP對(duì)生長(zhǎng)條件要求苛刻，生長(zhǎng)緩慢，一般3～7 d培養(yǎng)出陽(yáng)性結(jié)果，有時(shí)甚至10 d以上[36]，而且不能在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。目前較多采用BCYE及在其基礎(chǔ)上加入抗生素組合GVPC制成的選擇性培養(yǎng)基，標(biāo)本可取自供水系統(tǒng)、痰液、胸水、氣管灌洗液等，亦有用細(xì)胞培養(yǎng)和阿米巴培養(yǎng)檢測(cè)LP的報(bào)道[37]。分離培養(yǎng)作為檢測(cè)LP的金標(biāo)準(zhǔn)特異性高，對(duì)LP致病機(jī)制、毒力、耐藥發(fā)生、分型等研究意義重大，還可以為臨床確診提供病原證據(jù)，但敏感性低、價(jià)格昂貴、培養(yǎng)周期長(zhǎng)，不適于臨床快速診斷。

(2)PCR法：自1989年Starnbach等[38]首次采用PCR檢測(cè)出水中LP的DNA后，PCR法已能夠檢測(cè)出已知的LP所有血清分型。PCR法可對(duì)環(huán)境中的水樣及臨床感染患者的鼻咽拭子、尿液、胸水、痰液等進(jìn)行DNA檢測(cè)，常用的PCR引物有軍團(tuán)菌屬的特異性引物5S rRNA、16S rRNA基因、mip基因及染色體引物L(fēng)EG[39]，而且在LP感染早期將mip基因作為引物聯(lián)合尿抗原法較單獨(dú)采用PCR法檢測(cè)確診率高11%[40]。PCR法無(wú)論在臨床病原診斷，還是環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)中均有一定的優(yōu)勢(shì)，但操作復(fù)雜、儀器昂貴，多在科研及商業(yè)中應(yīng)用。近年來(lái)在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，先后發(fā)展的套式PCR、半套式PCR、多重PCR、巢式PCR、 real-time PCR等技術(shù)則更適用于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，而且通過減少產(chǎn)物污染、避免交叉反應(yīng)、降低假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)一步提高了靈敏度和特異度。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，其在臨床快速診斷中的應(yīng)用將越來(lái)越受到歡迎。

(3)LP抗體檢測(cè)：作為診斷LP感染的傳統(tǒng)方法，仍被眾多實(shí)驗(yàn)室采用?；颊吒腥綥P后約1周產(chǎn)生特異性IgM抗體，而特異性IgM抗體第二周左右可檢測(cè)到，IgM抗體雖然出現(xiàn)晚，但體內(nèi)存在時(shí)間長(zhǎng)，可以作為回顧性診斷的依據(jù)[41]。進(jìn)行病原診斷時(shí)，因單次血清結(jié)果無(wú)法區(qū)分新近感染還是既往感染，需采集急性期和恢復(fù)期雙份血清，檢測(cè)方法包括IFA、微量凝集法 (micro- agglutination, MAA)、ELISA等。以IFA、ELISA應(yīng)用最為普遍，其中IFA最早用于LP抗體的檢測(cè)，可以在感染初期檢測(cè)到LP特異性IgM 抗體。MAA無(wú)需特殊儀器，能檢測(cè)特異性IgM 抗體，檢測(cè)方便、價(jià)格低廉，適于基層單位LP的早期診斷[42]。ELISA可檢測(cè)特異性IgG抗體，已發(fā)展成自動(dòng)檢測(cè)法，結(jié)果準(zhǔn)確、客觀，文獻(xiàn)報(bào)道其敏感度高于IFA和MAA[43]，被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室采用，但多用于回顧性診斷和流行病學(xué)調(diào)查，而不是LP的早期診斷中。因機(jī)體感染LP后產(chǎn)生特異性抗體存在窗口期，過早行急性期或恢復(fù)期抗體檢測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。另外部分健康人存在隱性感染的可能， 相關(guān)研究表明LP抗體在33%的患者感染2年后仍可檢出[36]，因而血清學(xué)檢測(cè)不適合作為L(zhǎng)P感染的早期診斷方法，故LP抗原檢測(cè)已成為應(yīng)用較廣泛的方法。

(4)LP抗原檢測(cè)：LP抗原檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)，可以為臨床提供早期、快速的病原診斷，敏感性及特異性較好，可作為臨床實(shí)驗(yàn)室診斷LP的常規(guī)方法。常用的有EIA、放射免疫法(radioimmunoassay, RIA)、免疫層析法(immunochromatography, ICT)、直接熒光抗體法(direct fluorescent antibody, DFA)等，以ICT應(yīng)用最為廣泛，是針對(duì)LP1的抗原快速檢測(cè)方法，已制作成商品化的試劑盒。其中天津瑞愛金生物科技有限公司采用膠體金免疫層析法(gold immunchromatographic assay，GICA)，基于抗原抗體反應(yīng)的LP抗原檢定卡，15min便可讀取檢測(cè)結(jié)果，能夠?qū)Σ∏榈脑缙谠\斷提供有力證據(jù)[44]，有一定的特異性和敏感性[45]，其不足的是僅能檢測(cè)常見的LP1型。

非典型病原體是CAP的重要病原體，可以造成各年齡段的人群感染致病。目前檢測(cè)非典型病原體的方法很多，單靠一種方法診斷病原菌仍比較困難，分離培養(yǎng)法過去作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，因技術(shù)操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)不適合臨床應(yīng)用。近年來(lái)隨著免疫標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，其所具有快速、簡(jiǎn)便、適合大樣本篩查等優(yōu)點(diǎn)，能為疾病的及時(shí)診治提供有力的病原證據(jù)，更適合臨床需求，但對(duì)于呼吸道非典型病原體的診斷，臨床上可采取聯(lián)合應(yīng)用兩種以上方法檢測(cè)以增加敏感度。

參 考 文 獻(xiàn)

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