我國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展歷程

宋媛媛 鄭惠文 趙雁林

結(jié)核病是一種古老的疾病，在人類歷史上肆虐了數(shù)千年，已經(jīng)造成包括雪萊、契訶夫和諸葛亮等在內(nèi)的數(shù)以千萬計(jì)甚至是無以計(jì)數(shù)的人死亡，一度曾被稱為“白色瘟疫”。從伏曦畫八卦，制九針。神農(nóng)嘗百草，始有醫(yī)藥。黃帝教民治百病，埃及、希臘神話，荷馬史詩(shī)等中的醫(yī)學(xué)史里可以看到，人類一直在同疾病做斗爭(zhēng)，人類的醫(yī)學(xué)史也是人類同疾病做斗爭(zhēng)的歷史，在業(yè)內(nèi)人士的共同努力下，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)也伴隨著人類抗擊結(jié)核病工作的全面展開和深入而不斷發(fā)展和涌現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)室診斷是結(jié)核病診斷、治療及預(yù)防控制過程中所必需的。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查是發(fā)現(xiàn)傳染源的最主要手段，是確診結(jié)核病和選擇治療方案的主要依據(jù)，也是考核療效、評(píng)價(jià)防治效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作是全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃(NTP)的重要組成部分，在結(jié)核病防治工作中起著不可缺少的重要作用。筆者就我國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展歷程和應(yīng)用闡述如下。

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)的建立

解放初期，我國(guó)主要通過建立結(jié)核病療養(yǎng)院和傳染病醫(yī)院等來收治結(jié)核病患者，我國(guó)于1981年建立了結(jié)核病登記報(bào)告制度；1991年和1992年相繼開展世界銀行貸款結(jié)核病控制項(xiàng)目和中央加強(qiáng)與促進(jìn)結(jié)核病項(xiàng)目，標(biāo)志著我國(guó)開始開展系統(tǒng)的結(jié)核病防治工作，當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要以涂片為主，隨著結(jié)核病防治項(xiàng)目的不斷擴(kuò)展，涂片檢查實(shí)驗(yàn)室(痰檢室)逐步在國(guó)內(nèi)建立，1994年開始創(chuàng)建痰涂片質(zhì)量控制系統(tǒng)，到2000年已初步具備全國(guó)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)規(guī)模，質(zhì)控覆蓋面和力度逐年增加[1]。

2001—2004年，全國(guó)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)已逐步建立了獨(dú)立的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，我國(guó)進(jìn)一步健全了“國(guó)家級(jí)參比實(shí)驗(yàn)室→省級(jí)參比實(shí)驗(yàn)室→地(市)級(jí)實(shí)驗(yàn)室→縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室”四級(jí)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)。2004年制定《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃——痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》，并快速覆蓋到各級(jí)實(shí)驗(yàn)室。2004年前國(guó)家衛(wèi)生部統(tǒng)一部署在全國(guó)1/3的鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院設(shè)立了痰涂片檢查點(diǎn)，至2005年底共設(shè)立了9520個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點(diǎn)；從2008年起，我國(guó)開展培養(yǎng)、藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)和分子生物學(xué)診斷的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室逐年增多，根據(jù)《全國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃(2011—2015年)》的要求，到2015年底，將有80%縣級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室具備開展分枝桿菌培養(yǎng)的能力，100%的地市級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室具備藥敏試驗(yàn)的能力，100%的省級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室具備開展快速菌種鑒定的能力；我國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)工作模式主要是國(guó)家級(jí)、省級(jí)、地(市)級(jí)實(shí)驗(yàn)室分別負(fù)責(zé)對(duì)其下級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制、技術(shù)指導(dǎo)和培訓(xùn)等技術(shù)管理工作。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)

新中國(guó)成立后的很長(zhǎng)一段時(shí)期，在我國(guó)，以影像學(xué)檢查作為發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的主要手段，1951年孟昭赫撰寫了《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷法》，以1953年林建撰文詳細(xì)描述Mtb的細(xì)菌學(xué)檢查為標(biāo)志，我國(guó)開始使用集菌涂片法和痰分枝桿菌培養(yǎng)方法；1955年朱貴卿等引進(jìn)并改良了玻片培養(yǎng)法，鄭志平等用谷氨酸鈉替代天門冬酰胺制備分離培養(yǎng)基，隨后該培養(yǎng)基成為我國(guó)臨床分離培養(yǎng)的主導(dǎo)培養(yǎng)基一直沿用至今。1993年我國(guó)開始引入液體培養(yǎng)BACTEC TB 460快速檢測(cè)系統(tǒng)，該方法采用放射性核素技術(shù)對(duì)細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的具有放射性的代謝產(chǎn)物14CO2含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但因該底物有放射性，易污染環(huán)境，我國(guó)于1998年停止了該設(shè)備的使用；同年在我國(guó)引入MGIT 960系統(tǒng)即分枝桿菌生長(zhǎng)指示管(mycobacteria growth indicator tube，MGIT) 960系統(tǒng)，該方法是集分枝桿菌快速生長(zhǎng)培養(yǎng)、檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)技術(shù)為一體的全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)，解決了BACTEC TB 460存在的放射性污染問題，并保留了其快速的優(yōu)點(diǎn)，使結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查方法有了進(jìn)一步發(fā)展。1995年，國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室與WHO積極合作，組織開展全國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，自此引入了比例法藥敏試驗(yàn)，我國(guó)開始了絕對(duì)濃度法和比例法藥敏試驗(yàn)的并用時(shí)代。

目前，常用的自動(dòng)化液體培養(yǎng)系統(tǒng)主要有3種：(1) BACTEC MGIT 960自動(dòng)化培養(yǎng)系統(tǒng)，通過檢測(cè)液體培養(yǎng)基中消耗氧氣的量來確定是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，MGIT培養(yǎng)管底部的硅樹脂中含有氧淬滅熒光劑，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)過程中吸收散布在培養(yǎng)管中的氧氣，排放出CO2，隨著管中氧氣的逐漸損耗，熒光劑不再被抑制，當(dāng)使用紫外線(ultra-violet ray，UV)進(jìn)行觀察時(shí)，MGIT培養(yǎng)管便會(huì)發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度直接與氧氣的消耗呈正相關(guān)，對(duì)于Mtb來說，在陽(yáng)性情況下，每毫升培養(yǎng)基中大約有105～106個(gè)菌落形成單位(CFU)，如果6周(42 d)之后，該儀器仍為陰性，則表示培養(yǎng)管為陰性[2-7]；(2)BacT/ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng)，通過連續(xù)檢測(cè)接種標(biāo)本的培養(yǎng)瓶中CO2水平及其變化判斷是否有分枝桿菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)瓶底部含有顏色感應(yīng)器，此系統(tǒng)用一個(gè)比色計(jì)傳感器和反射光監(jiān)測(cè)溶解于培養(yǎng)基內(nèi)的CO2的存在和生成，當(dāng)培養(yǎng)瓶中有微生物生長(zhǎng)將產(chǎn)生CO2，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH 值改變，傳感器顏色從藍(lán)綠色變?yōu)辄S色，儀器每10 min自動(dòng)連續(xù)地檢測(cè)，如有顏色改變將自動(dòng)報(bào)警[8]；(3)Versa TREK/ESP全自動(dòng)快速血培養(yǎng)系統(tǒng)，通過自動(dòng)監(jiān)視培養(yǎng)基瓶子頂部的氧氣消耗量來查看Mtb的生長(zhǎng)，儀器通過壓力感應(yīng)器感應(yīng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的壓力變化，從而判斷是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。

分子診斷方法

20世紀(jì)90年代初，國(guó)內(nèi)眾多實(shí)驗(yàn)室開始使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，至1997年由于污染防控措施不到位，曾經(jīng)一度在結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室輔助診斷中停止使用；之后，經(jīng)過加強(qiáng)質(zhì)量管理等措施又逐步應(yīng)用到臨床檢測(cè)中。21世紀(jì)初始，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新型分子診斷技術(shù)大量涌現(xiàn)，因其通常具有較高的敏感度、特異度而日益顯示其優(yōu)越性，近年來在我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局獲批準(zhǔn)注冊(cè)的分枝桿菌快速分子診斷技術(shù)主要有：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、核酸探針技術(shù)、基因芯片(genechip)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(crossing priming amplification, CPA)和熔解曲線等檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)品。

實(shí)時(shí)熒光PCR熔解曲線法，是建立在野生型DNA分子和突變型DNA分子的GC含量不同的基礎(chǔ)之上，在PCR體系中加入兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的探針，在PCR過程中擴(kuò)增處與探針序列互補(bǔ)的單鏈核苷酸序列，在擴(kuò)增完成后增加熔解曲線分析過程，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光值的變化，通過計(jì)算熒光值與溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)，可獲得探針與該序列雜交產(chǎn)物的熔解曲線，并得出熔點(diǎn)(Tm值)，根據(jù)推斷該序列突變信息，從而檢測(cè)Mtb是否對(duì)利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇和氟喹諾酮類等藥物耐藥，我國(guó)正在對(duì)其可靠性和可行性進(jìn)行多中心臨床評(píng)估[9-10]。

基因芯片也叫DNA芯片、DNA微陣列、寡核苷酸陣列，是指采用原位合成(或顯微打印手段)，將DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)?；蛐酒瑢?duì)結(jié)核病的耐藥檢測(cè)基于Mtb針對(duì)不同藥物的基因突變位點(diǎn)不同，各突變位點(diǎn)與耐藥性有一定的相關(guān)性，通過檢測(cè)突變位點(diǎn)的DNA片段，來判定Mtb是否對(duì)利福平和異煙肼耐藥[11-12]，該方法經(jīng)過多中心評(píng)估，已經(jīng)在我國(guó)一些地區(qū)推廣應(yīng)用。

線性探針技術(shù)通過將PCR擴(kuò)增、反向雜交、膜顯色技術(shù)合為一體，通過引物擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上固定的特異性探針雜交，雜交物通過酶顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。線性探針檢測(cè)Mtb耐藥基于Mtb針對(duì)不同藥物的基因突變位點(diǎn)不同，各突變位點(diǎn)與耐藥性有一定的相關(guān)性，通過檢測(cè)出突變位點(diǎn)的DNA片段，來判定Mtb是否對(duì)利福平和異煙肼耐藥[13-14]，該方法經(jīng)過多中心評(píng)估，已經(jīng)在一些地區(qū)推廣應(yīng)用。

CPA是一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。CPA與其他技術(shù)相結(jié)合(如快速核酸提取技術(shù)、核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)等)，除包含具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶外，還主要包括擴(kuò)增引物和兩條交叉引物。這些寡聚核苷酸鏈能依靠嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus，Bst)DNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使DNA的循環(huán)擴(kuò)增能不斷的實(shí)現(xiàn)，從而確定受檢樣本中是否有Mtb的存在[15-16]。多中心臨床驗(yàn)證顯示，其敏感度和特異度與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相近[17]。

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(simulta-neous amplification test，SAT)是將核酸恒溫?cái)U(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)，在同一溫度下，首先通過莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)(100～1000個(gè))RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況[18-19]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是針對(duì)靶基因序列的不同區(qū)域設(shè)計(jì)幾種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65 ℃左右)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)的特點(diǎn)，對(duì)Mtb目的DNA片段進(jìn)行檢測(cè)從而獲得結(jié)核病信息的方法[20-21]。

半巢式全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Xpert Mtb/RIF)是一種半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR體外診斷技術(shù)，可對(duì)Mtb及其對(duì)利福平耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，該技術(shù)針對(duì)rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)其是否發(fā)生突變，進(jìn)而用于診斷患者是否罹患結(jié)核病及是否對(duì)利福平耐藥(rpoB序列存在突變)，該方法整合了基于定量PCR 分子遺傳檢測(cè)所需的3個(gè)步驟(樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測(cè))，將待檢樣品放入到Xpert的反應(yīng)盒中，系統(tǒng)將會(huì)自動(dòng)按照相應(yīng)的程序運(yùn)行，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR進(jìn)行情況[22-24]。該方法經(jīng)過多中心評(píng)估，已經(jīng)在我國(guó)一些地區(qū)使用。

熒光定量PCR是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化、并通過循環(huán)閾值(Ct值)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR指數(shù)增長(zhǎng)期的閉管信號(hào)檢測(cè)，不但檢測(cè)敏感度高、污染概率小，且可對(duì)初始模板進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)的定量，避免了傳統(tǒng)PCR主要針對(duì)線性增長(zhǎng)期或平臺(tái)期檢測(cè)的種種缺陷。依據(jù)檢測(cè)方式的不同，熒光定量PCR可大體分為熔解曲線分析和熒光化學(xué)檢測(cè)兩種，在Mtb檢測(cè)試劑盒中常見的TaqMan探針、分子信標(biāo)和雜交雙探針等均屬于后者。熒光定量PCR檢測(cè)的靶序列通常為16S rDNA、16S rRNA和23S rRNA間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)，僅存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MtbC)的插入序列IS6110，以及相對(duì)分子質(zhì)量為65 000的熱休克蛋白基因、recA基因、sodA基因、hsp65基因和rpoB基因等，主要檢測(cè)MtbC的存在與否。由于目前認(rèn)為MtbC由Mtb、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、肯尼迪分枝桿菌(M.canettii)、山羊分枝桿菌(M.caprae)和pinnipedii分枝桿菌7種菌種組成，我國(guó)除Mtb和牛分枝桿菌外其余菌種較罕見，而MtbC各成員間的DNA序列高度相似，具有共同的核心基因組，較難加以區(qū)分，故在臨床檢測(cè)中一般僅檢測(cè)MtbC存在與否即可。進(jìn)一步的鑒定可檢測(cè)pncA和oxyR基因的突變、PCR擴(kuò)增缺失區(qū)(region of deletion，RD)或mpt40-PCR等，可部分區(qū)分MtbC菌種。而綜合23S rDNA、gyrB基因和RD1側(cè)翼區(qū)域的檢測(cè)結(jié)果可鑒定大部分MtbC菌種，少數(shù)菌種需要全基因組序列分析方可區(qū)分[25-26]。

免疫學(xué)診斷技術(shù)

1890年Robert Koch制備了舊結(jié)核菌素，開創(chuàng)了結(jié)核病免疫學(xué)診斷的先河。1953年我國(guó)張學(xué)德等評(píng)估了敏感紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)；“文革”之后直到1980年，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)和單克隆技術(shù)逐步在我國(guó)建立和使用，目前常用的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)、斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測(cè)和蛋白芯片技術(shù)等。

2003年起，我國(guó)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)開始應(yīng)用γ干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)來確定結(jié)核潛伏感染(LTBI)者及結(jié)核病的輔助診斷。其中常用的方法有兩種。(1)基于全血的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。通過應(yīng)用Mtb特異性蛋白質(zhì)的多肽抗原[這些蛋白質(zhì)是早期分泌性抗原靶6 (ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)和TB7.7]與全血共孵育，由于BCG菌株及絕大部分的非結(jié)核分枝桿菌(M.kansasii、M.szulgai及M.marrinums除外)都不含有這3種蛋白質(zhì)，它們能夠刺激感染Mtb者的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的反應(yīng)，但在未感染者、或接種卡介苗但無結(jié)核病或LTBI風(fēng)險(xiǎn)者，則不會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)，利用酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并定量分析IFN-γ的濃度，判斷是否存在Mtb特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)[27-28]。(2)基于外周血淋巴細(xì)胞的免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)。通過將外周血淋巴細(xì)胞、Mtb特異的混合抗原A和B(分別為ESAT-6和CFP-10的部分多肽片段)，與對(duì)照試劑一起加入預(yù)先包被抗IFN-γ抗體的微孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中存在對(duì)Mtb的特異T細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液中加入的Mtb特異混合抗原A和B時(shí)將刺激其分泌IFN-γ。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ抗體捕獲，再次加入堿性磷酸酶標(biāo)記并針對(duì)不同IFN-γ表位的二抗與被捕獲IFN-γ結(jié)合，滯留在微孔板表面，顯色底物在反應(yīng)部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑點(diǎn)。每個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)Mtb特異的效應(yīng)T細(xì)胞。根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)可以推測(cè)體內(nèi)是否存在對(duì)Mtb反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞[29]。

從全球來看，結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國(guó)家主要集中在發(fā)展中國(guó)家。由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度所限，已經(jīng)被使用了百余年的痰涂片顯微鏡檢查技術(shù)和分離培養(yǎng)技術(shù)仍然是發(fā)展中國(guó)家結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷體系中所采用的主要方法。我國(guó)是發(fā)展中國(guó)家，結(jié)核病控制系統(tǒng)中目前奉行著以細(xì)菌學(xué)檢查作為發(fā)現(xiàn)傳染源和療效評(píng)定的主要手段，逐步推廣和應(yīng)用新型實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的態(tài)勢(shì)。目前，我國(guó)的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)中，已經(jīng)有1/3的縣(區(qū))至少有一家結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室配備了快速分子診斷技術(shù)；全國(guó)2/3的地(市)級(jí)中至少有一家結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室裝備了快速進(jìn)行Mtb耐藥檢測(cè)的分子診斷設(shè)備；全國(guó)幾乎100%的省級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室具備了快速分子菌種鑒定的能力。除此之外，通過分析分枝桿菌的生物標(biāo)志，從而確定其基因型，進(jìn)而分析Mtb在人群中的流行變異趨勢(shì)和分布情況的基因分型技術(shù)在各省已經(jīng)被廣泛使用，常用的基因分型方法主要有：IS6110-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(IS6110-RFLP)、可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)分析、分枝桿菌散在分布重復(fù)單位(Mycobacterial interpersed repetitive units，MIRU)分型、間隔區(qū)寡核苷酸分型(spoligotyping)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析、長(zhǎng)片段多態(tài)性分析(large sequence polymorphism，LSP)，以及缺失圖譜等方法?；蚍中图夹g(shù)可以在一定條件下追溯和確定傳染源，鑒別未知傳播，發(fā)現(xiàn)和鑒別培養(yǎng)的假陽(yáng)性。對(duì)于Mtb基因分型來講，目前可以選擇的手段較多，技術(shù)也比較成熟，如何對(duì)基因分型結(jié)果進(jìn)行詮釋是其關(guān)鍵所在。

小 結(jié)

我國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷體系已經(jīng)建立多年，總體上由三部分組成。第一，國(guó)家、省、地(市)和區(qū)(縣)的疾控機(jī)構(gòu)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室體系，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的地(市)級(jí)、區(qū)(縣)級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)前以細(xì)菌學(xué)檢查為主要技術(shù)手段，全國(guó)1/3的區(qū)(縣)級(jí)實(shí)驗(yàn)室配備了分子診斷設(shè)備，2/3以上的地(市)級(jí)實(shí)驗(yàn)室具備開展快速藥敏試驗(yàn)和分子生物學(xué)菌種鑒定的能力。第二，結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院和?？漆t(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，絕大多數(shù)可以開展涂片鏡檢、分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)等較為全面的細(xì)菌學(xué)檢查工作，也能夠采用快速培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)于一些特殊患者進(jìn)行鑒別診斷。第三，綜合醫(yī)療機(jī)構(gòu)的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，可以開展細(xì)菌學(xué)檢查和一些新的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。目前，在所有上述實(shí)驗(yàn)室中，涂片顯微鏡檢查的質(zhì)量控制體系主要在結(jié)核病防治系統(tǒng)內(nèi)得到了規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化，醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)科的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室正在逐步加入質(zhì)控體系和走向進(jìn)一步規(guī)范化的進(jìn)程中，傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)和分子診斷技術(shù)的質(zhì)量保證體系以及能力驗(yàn)證工作正在全國(guó)按計(jì)劃逐步擴(kuò)展，預(yù)計(jì)在2015年底前將全面覆蓋。

[1]趙雁林, 尚美. 我國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的現(xiàn)狀. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 30(7): 725-728.

[2]European Centre for Disease Prevention and Control. Mas-tering the basic of TB control: development of a handbook on TB diagnostic methods. Stockholm: European Centre for Di-sease Prevention and Control, 2011.

[3]Murray PR. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Wa-shington: American Society for Microbiology Press, 2007.

[4]Use of Liquid TB Culture and Drug Susceptibility Testing(DST) in Low and Medium Income Settings//World Health Organization. Summary report of the Expert Group Meeting on the use of liquid culture media. Geneva: World Health Organization, 2007.

[5]World Health Organization. Framework for implementing new tuberculosis diagnostics. Geneva: World Health Organization, 2010.

[6]World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part Ⅲ Culture. WHO/TB/98.258.Geneva: World Health Organization, 1998.

[7]World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis control. Part Ⅰ organization and management. WHO/TB/98.258. Geneva: World Health Organization, 1998.

[8]Thorpa TC, Wilson ML, Tumer JE, et al. BacT/Alert:an automated colorimetric microbial detection system. J Clin Microbiol,1990, 28(7):1608-1612.

[9]Huang Q, Liu Z, Liao Y, et al. Multiplex fluorescence mel-ting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS One, 2011, 6(4): e19206.

[10]胡思玉, 牛建軍, 權(quán)勝卯, 等. 探針熔解分析法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥突變的應(yīng)用和評(píng)價(jià). 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 34(10): 935-939.

[11]Pang Y, Xia H, Zhang Z, et al. Multicenter evaluation of genechip for detection of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol, 2013, 51(6): 1707-1713.

[12]周楊, 歐喜超, 樂軍, 等. 基因芯片診斷耐多藥結(jié)核病的臨床多中心研究. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 34(9): 793-799.

[13]Ling DI, Zwerling AA, Pai M. GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analy-sis. Eur Respir J, 2008, 32(5): 1165-1174.

[14]李強(qiáng), 歐喜超, 夏輝, 等. Genotype MTBDRplus 快速耐藥診斷方法在地市級(jí)結(jié)核病醫(yī)院應(yīng)用的評(píng)估研究. 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2013,14(1): 35-38.

[15]Fang R, Li X, Hu L, et al. Cross-priming amplification for rapid detection ofMycobacteriumtuberculosisin sputum specimens. J Clin Microbiol, 2009,47(3): 845-847.

[16]Ou X, Song Y, Zhao B, et al. A multicenter study of cross-priming amplification for tuberculosis diagnosis at peripheral level in China. Tuberculosis (Edinb), 2014,94(4):428-433.

[17]周靜宇, 徐生梅. 交叉引物擴(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2010,28(1): 22.

[18]倪麗麗, 羅柳林, 景玲杰, 等. 恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的臨床價(jià)值. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 35(8): 702-705.

[19]崔振玲, 沙巍, 黃曉辰, 等. RNA 恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的研究. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2012, 34(12): 894-897.

[20]Mori Y, Kanda H, Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): recent progress in research and development. J Infect Chemother, 2013, 19(3):404-411.

[21]Ou X, Li Q, Xia H, et al. Diagnostic accuracy of the PURE-LAMP test for pulmonary tuberculosis at the county-level laboratory in China. PLoS One, 2014, 9(5):e94544.

[22]Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D, et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N Engl J Med, 2010, 363(11): 1005-1015.

[23]Van Rie A, Page-Shipp L, Scott L, et al. Xpert?MTB/RIF for point-of-care diagnosis of TB in high-HIV burden, resource-limited countries: hype or hope. Expert Rev Mol Diagn, 2010, 10(7): 937-946.

[24]張治國(guó), 歐喜超, 孫倩, 等. 利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究. 中國(guó)防癆雜志, 2013, 35(1)：13-16.

[25]Del Portillo P, Murillo LA, Patarroyo ME. Amplification of a species-specific DNA fragment ofMycobacteriumtuberculosisand its possible use in diagnosis. J Clin Microbiol, 1991,29(10):2163-2168.

[26]Viana-Niero C, de Haas PE, van Soolingen D, et al. Analysis of genetic polymorphisms affecting the four phospholipase C (plc) genes inMycobacteriumtuberculosiscomplex clinical isolates. Microbiology, 2004,150(Pt 4):967-978.

[27]Andersen P, Munk ME, Pollock JM,et al. Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet, 2000, 356(9235):1099-1104.

[28]Balcells ME, Pérez CM, Chanqueo L, et al. A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int J Infect Dis, 2008,12(6):645-652.

[29]Higuchi K, Kawabe Y, Mitarai S, et al. Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med Microbiol Immunol, 2009, 198(1):33-37.