初步探究酶法制備草魚魚皮膠原蛋白ACE抑制肽

■ 雷亞君 唐亞麗 盧立新

（1.江南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)中國包裝總公司食品包裝技術(shù)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；3.江蘇省食品先進(jìn)制造技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

我國擁有非常廣闊的水域，水產(chǎn)品資源豐富且其中富含膠原蛋白，但水產(chǎn)品的加工研究滯后。膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)最多的蛋白質(zhì)，良好的生物相容性及可生物降解性及低抗原性[1]，使之被廣泛地用于食品及生物醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域中。由膠原蛋白水解得到的膠原肽有許多生理活性功能，例如ACE抑制肽、抗腫瘤肽以及抗氧化肽等[2]，所以以水產(chǎn)品為加工原料制備膠原肽有廣闊的前景。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin converting I enzyme,ACE)能調(diào)節(jié)血壓，當(dāng)其受到抑制時(shí)，血壓就會(huì)降低。Ferreira（1965）[3]在蛇的毒液中得到了ACE抑制肽,從此開啟了ACE抑制肽應(yīng)用的篇章。通過動(dòng)物（高血壓大鼠）和臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口服或是靜脈注射ACE抑制肽降血壓效果都很好[4-7]。用于臨床的合成ACE抑制劑易引起多種副作用，來自天然的ACE抑制肽則安全可靠,藥物毒副作用小,且易吸收，是人們研究的熱點(diǎn)。

ACE抑制肽主要通過酶法制得，然后用凝膠、反相色譜等方法分離純化。由于有ACE抑制活性的肽類大多是寡肽，寡肽一般由2～6個(gè)氨基酸組成，分子量段一般在1 000 Da以下，所以要盡可能提高寡肽產(chǎn)物的含量。本試驗(yàn)考察了酶解產(chǎn)物的肽得率、相對(duì)分子質(zhì)量分布和ACE抑制活性，比較四種酶對(duì)魚皮膠原蛋白的作用效果，并選出最優(yōu)酶種，得到最佳酶解條件。

蛋白酶是一類催化肽鍵水解的酶，它具有專一性，酶種不同，其酶的化學(xué)特性是不同的，導(dǎo)致某種蛋白酶可能只對(duì)某些肽鍵作用[8]。本試驗(yàn)用下面四種酶對(duì)魚皮膠原蛋白水解：①A.S.1398蛋白酶，是從枯草桿菌中得來的食品級(jí)中性蛋白酶[9]，被廣泛用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)；②Alcalase 2.4 L，NOVO酶制劑公司的產(chǎn)品，食品級(jí)，已被廣泛用于生物技術(shù)領(lǐng)域[10-13]；③Protease N，Amano酶制劑公司的產(chǎn)品，有較高的水解蛋白質(zhì)的能力，其作用得到含 3～5個(gè)氨基酸短肽的酶解產(chǎn)物比例較高；④木瓜蛋白酶，從木瓜胚乳中得到，屬于巰基蛋白酶,有較寬的底物特異性，能使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鏈-CO-NH-斷裂，使之生成小分子量的多肽類，已被廣泛用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)[14]。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和主要試劑

魚皮膠原蛋白(試驗(yàn)室制備)、Protease N（日本天野酶制品株式會(huì)社）、A.S.1398中性蛋白酶（無錫杰能科酶制劑公司）、Alcalase 2.4 L[丹麥諾維信(NOVO)公司]、木瓜蛋白酶(上海生物試劑公司 )、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)（美國Sigma公司）。

1.2 酶解魚皮膠原蛋白

向恒溫酶反應(yīng)器中加入魚皮膠原蛋白和水，攪拌，使之混勻。向反應(yīng)器中加酶，通過 0.5 mol/l NaOH保持反應(yīng)體系的pH值，用pH-stat法檢測(cè)水解度。在反應(yīng)結(jié)束后，用沸水浴滅酶15 min。在冷卻后離心30 min，取上清液，經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥。

1.3 蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)的測(cè)定

采用pH-stat法檢測(cè)水解度[15]。

1.4 相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定

儀器：Waters 600高效液相色譜儀；色譜柱：TSK-gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V）；檢測(cè)：UV220 nm；流速：0.5 ml/min；柱溫：30℃。將干燥后的魚皮酶解產(chǎn)物配成0.5 mg/ml的濃度；進(jìn)樣體積：20 μl。

1.5 測(cè)定酶解產(chǎn)物ACE抑制活性

采用色譜法測(cè)定ACE的活性，參照 Shu Hua Xia[10]中的方法。

色譜條件：HPLC系，美國Waters公司；色譜柱：Sun-FireTM C18 ODS（150 mm×4.6 mm），美國 Waters公司；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：12%乙腈（含 0.05%乙酸）。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶對(duì)魚皮膠原蛋白的水解

在酶與底物濃度比([E]/[S])為相同（3 000 U/g）的情況下，通過肽得率比較幾種蛋白酶在各自最適的情況下對(duì)魚皮膠原的酶解效果(見表1)。

表1 幾種酶對(duì)魚皮膠原酶解效果比較

由表1可知，水解魚皮膠原肽得率最高的是Protease N和A.S.1398，其酶解效果優(yōu)于另外兩種蛋白酶，所以選擇這兩種酶水解魚皮膠原。

2.2 酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量

酶的作用位點(diǎn)是不同的，所以即使在水解度條件相同的情況下，其產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布也不同。蛋白質(zhì)可以通過兩種形式被吸收，即肽和氨基酸。肽與游離氨基酸運(yùn)輸方式不同，肽的吸收高效迅速，特別是寡肽[11-12]；而高滲透性的游離氨基酸易導(dǎo)致腹瀉[13]。肽鏈中氨基酸殘基的數(shù)目對(duì)活性有很大的影響[16-17]。因此，相對(duì)分子質(zhì)量的含量是酶解產(chǎn)物需要考慮的指標(biāo)。

表2所示是當(dāng)水解度為16%時(shí)，兩種酶對(duì)魚皮膠原蛋白酶解作用產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布和游離氨基酸的含量。由表2可知，當(dāng)水解度相同時(shí)，A.S.1398的酶解產(chǎn)物中，分子量800～150 Da的比例達(dá)到72.36%，而分子量小于150 Da的僅占0.94%，所以寡肽較多，游離氨基酸較少。故得出，A.S.1398對(duì)魚皮膠原水解的作用效果較好。

表2 魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布和游離氨基酸的含量

2.3 酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性

測(cè)定兩種酶解產(chǎn)物的ACE抑制率，兩種酶解產(chǎn)物濃度均為1.5 mg/ml(見圖 1)。

圖1 兩種酶解產(chǎn)物的ACE抑制率與水解度的關(guān)系

由圖1可知，水解度相同時(shí)，A.S.1398酶解產(chǎn)物的ACE活性較高，且隨著水解度(DH)升高而增加，可能是由于酶對(duì)底物的特異性以及作用位點(diǎn)的不同所造成的。一般情況下，較小分子量的肽有ACE抑制活性，這與表2的結(jié)果也是一致的。

2.4 影響A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的因素

2.4.1 底物濃度的影響

底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)有著重要的影響，酶與底物的結(jié)合隨著底物濃度的增加而增多，從而提高反應(yīng)速率。在酶解溫度為50℃，6%的A.S.1398加入量，在pH值為7.0情況下，觀察底物濃度對(duì)水解度的影響(見圖2)。

圖2 不同底物濃度對(duì)A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的影響

由圖2可知，在3個(gè)底物濃度中，A.S.1398于濃度為5%時(shí)對(duì)魚皮膠原的水解作用是最好的，底物濃度增加到7%時(shí)，水解度反而下降了。這說明底物抑制現(xiàn)象會(huì)在魚皮膠原蛋白的酶解過程中產(chǎn)生，所以較適宜的底物濃度為5%。

2.4.2 酶解溫度的影響

在底物濃度[S]為5%，酶與底物濃度比([E]/[S])為6%，且pH值為7.0的情況下，研究酶解溫度對(duì)水解度的影響(如圖 3)。

圖3 不同酶解溫度對(duì)A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的影響

圖3中顯示，3個(gè)酶解溫度中，A.S.1398于50℃時(shí)對(duì)魚皮膠原的水解效果是最好的。隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)，水解度顯著升高。但在55℃時(shí)，DH數(shù)值反而降低了。所以，A.S.1398酶解魚皮膠原的較適宜溫度在50℃左右。

2.4.3 pH值的影響

pH值的影響是多重的，不僅對(duì)酶的穩(wěn)定性，對(duì)酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物也有作用。在底物濃度為5%的情況下，加酶量為6%，酶解溫度為50℃，觀察此時(shí)不同pH值對(duì)水解度的影響(見圖4)。

圖4 不同pH值對(duì)A.S.1398水解魚皮膠原蛋白的影響

由圖4可知，在3個(gè)pH值中，A.S.1398于pH值在6.5時(shí)對(duì)魚皮膠原的水解作用是最好的，水解度隨著反應(yīng)液的pH值的升高而下降。所以，pH值6.5是A.S.1398水解魚皮膠原蛋白最適宜的pH值。

2.5 魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的組成分析

由以上確定最佳酶種為A.S.1398，最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度為50℃，底物濃度為5%，pH值為6.5。在此情況下對(duì)魚皮膠原作用，其酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布見表3。由表3可知，分子量為800～150 Da所占比例高達(dá)72.48%，所以酶解產(chǎn)物中含寡肽較多。

表3 魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)中，考察了酶解產(chǎn)物的肽得率、相對(duì)分子質(zhì)量分布和ACE抑制活性這三個(gè)方面。由試驗(yàn)得出，在四種酶中，A.S.1398是水解魚皮膠原蛋白的最佳酶種，其最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度50℃，底物濃度5%，pH值6.5，此時(shí)得到ACE抑制性較好的膠原蛋白肽。與合成藥物相比，天然來源的ACE抑制活性肽安全可靠，藥物副作用小，是人們研究的熱點(diǎn)。今后應(yīng)進(jìn)一步對(duì)魚皮膠原蛋白ACE抑制肽進(jìn)行分離純化并研究其作用機(jī)理，為漁業(yè)資源的綜合開發(fā)利用提供技術(shù)支持。