抗體庫技術(shù)

惠光艷 賈文敏 石樺 周國清 顏晗 單守勤(濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院，266071)

·綜述·

抗體庫技術(shù)

惠光艷 賈文敏 石樺 周國清 顏晗 單守勤(濟(jì)南軍區(qū)青島第一療養(yǎng)院，266071)

由于抗體在診斷和治療等多方面有極其重要的應(yīng)用，針對(duì)各界對(duì)抗體的不同需求，目前已發(fā)展并完善起一種新的生物學(xué)技術(shù)——抗體庫技術(shù)。該技術(shù)可同時(shí)有效的處理大量抗體分子，不經(jīng)動(dòng)物的陰性選擇，從任一種屬中獲得少有的親和力高、專一性強(qiáng)的抗體。本文將此技術(shù)作一介紹。

抗體庫；體外成熟；陽性克隆

1989年，Ward等報(bào)道[1]了由重鏈可變區(qū)組成的單區(qū)抗體庫，同年Huse等用PCR法建立了全套抗體、輕鏈庫和全套重鏈Fd段基因庫。他們把所有輕鏈片段和重鏈Fd(VH＋CH1)段分別克隆到λZap改造的表達(dá)載體中，構(gòu)成輕重鏈庫，然后將這兩個(gè)庫隨機(jī)重組形成了組合抗體庫。由于在V基因的5'端有分泌信號(hào)序列，所表達(dá)的Fab可分泌到細(xì)菌外。對(duì)這種λ噬菌體抗體庫組合文庫仍采用傳統(tǒng)的“膜原位雜交法”篩選特異性抗體，所以對(duì)庫容量為106～107篩選時(shí)其工作量之大是可想而知的。

為了克服隨機(jī)組合抗體庫的隨機(jī)性強(qiáng)，庫容量大，篩選工作量大和不易獲得特異性抗體的缺點(diǎn)，1991年將噬菌體表面遞呈技術(shù)引入抗體庫的構(gòu)建，出現(xiàn)了噬菌體抗體庫。

來自人外周血、脾和骨髓淋巴細(xì)胞的cDNA，用PCR法擴(kuò)增出抗體基因，已分泌Fab或ScFv的形式克隆到噬菌粒載體中，構(gòu)建人源抗體庫。

1 抗體庫的構(gòu)建與工程抗體的體外成熟

1.1 抗體庫的構(gòu)建 由于抗體的親和力和特異性主要由抗體的可變區(qū)決定，因而對(duì)抗體進(jìn)行體外成熟時(shí)，幾乎都是對(duì)抗體的可變區(qū)進(jìn)行突變，既可選擇對(duì)整個(gè)抗體可變區(qū)進(jìn)行突變，也可選擇對(duì)抗體可變區(qū)的某一個(gè)或某幾個(gè)小范圍區(qū)域進(jìn)行突變。在抗體的可變區(qū)中，與抗原結(jié)合最密切的是6個(gè)CDR，而在這6個(gè)CDR中，CDR3不僅在抗原的結(jié)合方面貢獻(xiàn)最大，而且其與可變區(qū)其他部分(如CDR和FR等)的相互作用較其他4個(gè)CDR多，另外HCDR3的構(gòu)象和長度的變化也較其他5個(gè)CDR多，因而當(dāng)選擇局部胞外突變時(shí)，通常選擇抗體可變區(qū)的某一個(gè)或某幾個(gè)CDR中(尤其是HCDR3和LCDR3)進(jìn)行突變。根據(jù)突變引入的方法，可大致分為胞內(nèi)突變和胞外突變。

胞內(nèi)突變是利用大腸桿菌突變株mutD5實(shí)現(xiàn)的。菌株E.coli.mutD5的DNA聚合酶Ⅲ的ε亞單位缺陷，因而導(dǎo)致該3'→5'的外切功能(即教正功能)缺失，從而導(dǎo)致其DNA聚合酶合成DNA時(shí)的高度致錯(cuò)性。在用豐富培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，其致錯(cuò)率也較野生性DNA聚合酶提高103～105倍，即使在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其致錯(cuò)率也較野生性聚合酶高10～50倍。其突變是在整個(gè)抗體可變區(qū)中隨機(jī)引入，而且其突變類型主要為單堿基置換(95%)，也有少量的單堿基移碼突變(5%)，但各位置的突變率與鄰近序列密切相關(guān)[2]。Low等[3]利用E.coli.mutD5對(duì)抗a.phOx單鏈抗體進(jìn)行了胞內(nèi)突變，并用噬菌體呈現(xiàn)的方法進(jìn)行了篩選，得到親和力提高100倍的突變體。而且對(duì)突變規(guī)律進(jìn)行了分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在突變率和突變類型等方面，該胞內(nèi)突變系統(tǒng)與B細(xì)胞的超突變有驚人的相似性。

與胞內(nèi)突變的方法較單一相比，胞外突變的方法顯得更豐富。單選擇整個(gè)抗體可變區(qū)進(jìn)行突變時(shí)，一般可利用DNA重排(DNAshuffling)和致錯(cuò)PCR(error-pronePCR)等方法實(shí)現(xiàn)。DNA重排是將一組密切相關(guān)的核酸序列隨機(jī)片段化，這些片段通過重組裝PCR得到全長的核酸序列，在這個(gè)過程中引入突變并對(duì)不同的突變進(jìn)行廣泛的重組，從而完成對(duì)目的核酸序列的迅速進(jìn)化，從而提高核酸序列或其蛋白的功能[4]。DNA重排一般包括3個(gè)步驟：用DNase1對(duì)目的基因隨機(jī)片段化、重組裝PCR和重組體的克隆和篩選，而篩選到的目的功能重組體又可作為下一輪重排的出發(fā)點(diǎn)。在DNA的重排過程中，由于配對(duì)的不精確性而引入突變和重組，其突變種類包括點(diǎn)突變、缺失、插入、顛倒、整和等自然界廣泛存在的突變。其突變率可以通過控制緩沖液的組成、DNA隨機(jī)片段的大小、DNA聚合酶的種類(Taq，pfu，pwo)等方法來實(shí)現(xiàn)，一般可控制在0.05%～0.7%之間[5]。利用DNA重排方法，Crameri等對(duì)單鏈抗體進(jìn)行突變，篩選到表達(dá)水平和親和力都明顯提高的突變體[6]，而Proba等[7]也得到無二硫鍵但能夠正確折疊的單鏈抗體突變體。

致錯(cuò)PCR是在標(biāo)準(zhǔn)PCR基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行適當(dāng)修改以增加PCR過程中的突變率。包括提高M(jìn)gcl2的濃度至7 mmol/L以穩(wěn)定非配對(duì)的堿基對(duì)；加入0.5 mmol/L Mncl2以降低TaqDNA聚合酶對(duì)模板的特異性；dCTP和dTTP的濃度增加至1 mmol/L以促進(jìn)錯(cuò)誤摻入；提高聚合酶的使用量至5 U/100 μL以促進(jìn)延伸鏈在堿基錯(cuò)配位置得以繼續(xù)延伸。致錯(cuò)PCR可提高每一個(gè)核苷酸的錯(cuò)誤率至大約7×10-3，而且這種錯(cuò)誤率沒有序列傾向性，并且所有的突變幾乎都為堿基置換，插入和缺失的頻率加在一起小于0.05%。利用致錯(cuò)PCR可在抗體的整個(gè)突變區(qū)完全隨機(jī)的引入突變[8-10]。

1.2 抗體庫的篩選 抗體庫的篩選是從構(gòu)建的抗體庫中篩選出對(duì)目的抗原特異的抗體，其是抗體體外成熟的中心環(huán)節(jié)?？贵w庫的篩選涉及到兩個(gè)方面，即抗體庫的呈現(xiàn)和抗體庫中陽性克隆的富集。

現(xiàn)在，已有多種抗體庫的呈現(xiàn)手段和方法，比如，細(xì)菌表面呈現(xiàn)、質(zhì)粒呈現(xiàn)、核糖體呈現(xiàn)等，而現(xiàn)今應(yīng)用最為廣泛的是噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)，現(xiàn)就以次為例介紹抗體庫的呈現(xiàn)[11-12]。

噬菌體表面呈現(xiàn)方法是Smith在1985年建立，最初是用于多肽文庫的呈現(xiàn)。20世紀(jì)90年代初，McCafferty等[13]將該方法成功地用于抗體庫的呈現(xiàn)。其基本原理是將抗體片段和M13噬菌體的基Ⅲ蛋白(gⅢ)的融合基因克隆在一個(gè)噬菌體表達(dá)載體上，通過輔助噬菌體的超感染，組裝出在表面呈現(xiàn)抗體片段的重組噬菌體。

抗體庫噬菌體表面呈現(xiàn)的關(guān)鍵在于抗體片段與gⅢ蛋白的融合。M13噬菌體的gⅢ蛋白在每個(gè)噬菌體上有3～5個(gè)拷貝，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT 3個(gè)功能域，該3個(gè)功能域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中N1和N2與噬菌體結(jié)合大腸桿菌的性菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)，而CT是構(gòu)成噬菌體外膜蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)gⅢ蛋白的N端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端?？贵w庫表面呈現(xiàn)系統(tǒng)經(jīng)過十多年的發(fā)展，在抗體片段與gⅢ蛋白的融合方面出現(xiàn)了兩種融合方式。在Phamacia公司提供的噬菌粒pCABTAB5E中，單鏈抗體融合在gⅢ蛋白的信號(hào)肽(SgⅢ)和N1之間，該系統(tǒng)保留了完整的gⅢ蛋白，即所謂的長融合。而Krebber等人構(gòu)建的用于抗體庫表面呈現(xiàn)的噬菌粒pAK200中[14]，單鏈抗體C端直接與gⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，即實(shí)現(xiàn)短融合(short fusion)。在短融合時(shí)，重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整的gⅢ蛋白來提供。短融合不僅能大幅度降低噬菌體載體的長度(N1的N2結(jié)構(gòu)域的編碼基因長約1 000 bp)而且能夠有效降低因大量表達(dá)蛋白而導(dǎo)致的對(duì)宿主菌的毒性和降低其對(duì)輔助噬菌體超感染的抑制效應(yīng)。

呈現(xiàn)在噬菌體表面的抗體庫的富集方法有固相富集和液相富集兩種方法。抗體庫的固相富集十時(shí)毫利用包被在固相載體(如酶聯(lián)板、組織培養(yǎng)瓶或免疫管等)上的抗原結(jié)合呈現(xiàn)在噬菌體表面功能抗體而實(shí)現(xiàn)的。而液相富集是首先利用生物素標(biāo)記的抗原(biotinylated-Ag)在液相中結(jié)合表面呈現(xiàn)功能抗體的重組噬菌體一，然后利用親和素偶聯(lián)的瓊脂糖(steptavidin-agrose)或親和素偶聯(lián)的滋珠來捕獲與biotinylated-Ag結(jié)合的重組噬菌體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體庫中功能抗體的富集。這兩種富集方法各有其特點(diǎn)：固相富集方法是最經(jīng)典的富集方法，其結(jié)合-洗脫等每個(gè)環(huán)節(jié)都有比較成熟的實(shí)驗(yàn)參數(shù)可以參考，具有良好的重復(fù)性。而液相富集有利于保持抗原的天然構(gòu)象，而且能夠精確控制富集時(shí)抗原的濃度，從而能夠以低濃度抗原篩選到高親和力的抗體。但在實(shí)際工作中要考慮周到，抗原的生物素標(biāo)記可能會(huì)影響抗原上的抗體結(jié)合表位從而可能破壞抗體-抗原的結(jié)合，而且大分子抗原的生物素標(biāo)記效果往往較差。另外液相富集時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)較高的篩選背景，因此需要對(duì)富集過程的洗滌條件進(jìn)行優(yōu)化和嚴(yán)格的控制以盡量降低富集過程中的背景以提高富集效果。

為了進(jìn)一步降低對(duì)噬菌體表面呈現(xiàn)的抗體庫進(jìn)行篩選時(shí)的背景，Krebber等[15]在噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展了選擇性感染噬菌體技術(shù)(selective infective phage SIP)。該方法的基本原理是基于短融合的噬菌體表面呈現(xiàn)系統(tǒng)。但在SIP系統(tǒng)中所使用的輔助噬菌體不能提供完整的gⅢ蛋白，其制備的重組噬菌體表面呈現(xiàn)抗體但缺乏完整的gⅢ蛋白，因而這些重組噬菌體自身并不能感染大腸桿菌。而SIP系統(tǒng)的另一個(gè)特點(diǎn)是篩選用的目的抗原必須與制備的gⅢ蛋白的N1-N2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行體外的化學(xué)交聯(lián)(Ag-N1-N2)。只有那些在表面呈現(xiàn)功能抗體的噬菌體才能通過抗原-抗體作用而恢復(fù)其感染性而得到擴(kuò)增。因而SIP技術(shù)能夠大大降低噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)的篩選背景，提高了篩選效率。

在對(duì)噬菌體表面呈現(xiàn)的抗體庫進(jìn)行篩選時(shí)常用到的另一個(gè)方法是去篩選(deselection)，該方法在篩選高特異性抗體時(shí)被廣泛使用。去篩選是先在制備的重組噬菌體溶液中加入具有交叉反應(yīng)的抗體進(jìn)行封閉，隨后再用目的抗原對(duì)封閉后的抗體庫進(jìn)行富集，從而極大地提高了從抗體庫中篩選出高特異性抗體的效率。Parsons等[16]利用該方法對(duì)一株與HbA(adult haemoglobin)有交叉反應(yīng)的抗HbF抗體進(jìn)行了體外成熟，得到特異性明顯提高的抗HbF(foetal haemoglobin)抗體。而且Hemminki等[17]利用去篩選方法也得到了特異性明顯改善的抗睪丸激素抗體。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)抗人纖維蛋白單鏈抗體進(jìn)行體外成熟時(shí)，利用去篩選策略篩選到特異性提高的單鏈抗體。

1.3 陽性克隆的鑒定 陽性克隆的鑒定是抗體體外成熟的最后一個(gè)環(huán)節(jié)，其目的是從經(jīng)多輪富集后的抗體庫中鑒定出生物特性明顯改善的單克隆。陽性克隆的鑒定方法是與抗體庫的篩選方法密切相關(guān)的。

當(dāng)抗體庫用噬菌體表面呈現(xiàn)方法進(jìn)行篩選時(shí)，則既可以用噬菌體ELASA方法對(duì)大量單克隆進(jìn)行定性鑒定，也可以用分泌的可溶性抗體進(jìn)行常規(guī)ELASA鑒定，Griep等[18]在1999年建立了一種新的陽性克隆鑒定方法，即將經(jīng)多輪富集所得的單鏈抗體的混合基因克隆到堿性磷酸酶系統(tǒng)，從而構(gòu)建出單鏈抗體-堿性磷酸酶融合表達(dá)單元，經(jīng)進(jìn)一步ELASA就可實(shí)現(xiàn)對(duì)單克隆的鑒定，該方法避免了使用任何酶標(biāo)二抗，不僅簡便、經(jīng)濟(jì)，而且有效的降低了假陽性比例。

陽性克隆的進(jìn)一步細(xì)致的定量分析則需要首先對(duì)選出的陽性克隆進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)表達(dá)的抗體進(jìn)行純化。最直接的定量分析方法是利用Pharmacia公司的BLAcore設(shè)備測(cè)定抗體的Kd值[19]。另外，Mackenzie等[20]建立的環(huán)磷酰胺洗脫法可方便地比較針對(duì)同一抗原的不同抗體的相對(duì)親和力，因而特別適合于比較來自同一抗體庫的不同克隆的相對(duì)親和力。

2 抗體庫的應(yīng)用與展望

2.1 在腫瘤診斷與治療方面的應(yīng)用 利用腫瘤相關(guān)抗原和腫瘤特異性抗原篩選體，用于腫瘤的診斷，免疫成像定位，并有助于對(duì)腫瘤標(biāo)志物的研究。腫瘤特異性抗體可選擇性識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，由抗體結(jié)合區(qū)與病毒和化療藥物相融合而制成“導(dǎo)向藥物”，能有效的特異性摧毀腫瘤。

最近，Goodson等[21]用肽庫篩選出與尿激酶結(jié)合的配體，據(jù)說人腫瘤細(xì)胞的侵入概率與結(jié)合受體的尿激酶正相關(guān)。

2.2 藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用 傳統(tǒng)藥物的發(fā)現(xiàn)過程是對(duì)活細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行篩選，費(fèi)時(shí)、費(fèi)功，而某些疾病由于沒有適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，而限制了對(duì)其治療藥物的發(fā)現(xiàn)。肽庫和抗體庫的出現(xiàn)，可用于醫(yī)學(xué)上感興趣的受體篩選出相應(yīng)的配體，利用受體和配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合其他的技術(shù)用于藥物設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。例如，在目前條件下研究具有較大毒性細(xì)菌脂多糖的結(jié)構(gòu)是很困難的，甚至是不可能的，利用抗體庫制備出來的抗體完全可以模仿其生物活性構(gòu)型。由于抗體片段是由多肽構(gòu)成的，在體內(nèi)不穩(wěn)定，不能直接用做藥物進(jìn)行治療，但可以利用較穩(wěn)定的與其構(gòu)型相同或相似的芳香族化合物來替之，用做藥物的生產(chǎn)和臨床治療。目前，在腦卒中(stroke)病人的治療中，有研究已證實(shí)運(yùn)用抗粘附分子抗體來阻斷粘附分子，可減輕腦組織的損害[22]。此外，對(duì)于多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病(multifocal motor neuropathy，MMN)的治療臨床多采用環(huán)磷酰胺及人免疫球蛋白，應(yīng)用人抗體治療MMN患者后常可見到癥狀性改善，但有效期長短各異。因此，抗體用于臨床治療這一領(lǐng)域預(yù)計(jì)會(huì)有很大的突破。

2.3 植被表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用 在植物體內(nèi)可以表達(dá)完整有活性的抗體分子且能糖基化，通過有性雜交途徑可以遺傳給后代，這樣可以大大的降低抗體生產(chǎn)成本。也許有一天，人們只要直接食用植物，就可以預(yù)防和治療某些疾病。

目前，人們?cè)谀承┲参锊『?特別是真菌病害和某些病毒病)面前束手無策，要減輕和預(yù)防這些病害的危害，每年要花費(fèi)大量的人力物力，使用超量的農(nóng)藥。

抗體庫技術(shù)作為抗體研究的一個(gè)前沿領(lǐng)域，各方面正在日趨成熟和完善，而且正在出現(xiàn)一些新的方法和新技術(shù)。隨著抗體庫技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，抗體的獲取工作將會(huì)更方便、更富有成效。這使得提高各種人源化抗體和小分子抗體片段的親和力和特異性成為可能，為抗體的發(fā)展開創(chuàng)了更廣闊的前景。

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It has been proved that antibodies are extremely important in the medical diagnosis and treatment.To meet the diverse demands of antibodies in different fields，a new biotechnology known as antibody library has been developed and improved.This biotechnology can simultaneously deal with a large number of antibodies in an efficient way，and then obtain rare antibodies with high specificity and affinity from any species without negative selection of animals.This review is focused on the constructions，applications and prospects of this biotechnology.

Antibody library；In vitro maturation；Positive clone

2014-08-19)

全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”課題計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(BWS11J003)

1005-619X(2014)11-0969-03

10.13517/j.cnki.ccm.2014.11.004