牛A－FABP與SREBP1基因的組織表達(dá)規(guī)律研究

張 樂(lè)，彭 燮，劉 揚(yáng)，付常振，王洪寶，2＊，昝林森，2＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100；2.國(guó)家肉牛改良中心，陜西楊凌712100）

牛肉是我國(guó)傳統(tǒng)的高檔消費(fèi)肉類(lèi)制品，具有瘦肉多、脂肪少、蛋白高、膽固醇低等特點(diǎn)，其必需氨基酸含量均衡，具有較多的維生素和微量元素，是人類(lèi)理想的食品之一［1］。衡量牛肉品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)是牛肉的大理石花紋含量。大理石花紋含量的多少主要由肌肉脂肪含量的多少?zèng)Q定。

脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid－binding proteins，F(xiàn)ABPs）參與脂類(lèi)代謝和脂肪的沉積的調(diào)控，它的表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量有密切聯(lián)系。尤其是脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白基因（adipocyte fatty acid－binding protein，A－FABP），研究表明A－FABP只在脂肪中表達(dá)，對(duì)于脂肪的沉積可以在不同水平起到一定的調(diào)控作用［2－5］。Briggs等（1993）從Hela 細(xì)胞核中抽提純化出來(lái)的一種蛋白，它能夠和固醇調(diào)節(jié)元件蛋白相結(jié)合，故稱為固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，即SREBP。它是動(dòng)物體內(nèi)脂肪合成的一個(gè)極重要的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)與脂肪生成相關(guān)的酶（生脂酶）的基因轉(zhuǎn)錄水平而調(diào)節(jié)這些酶的活性，從而控制體內(nèi)脂肪合成。大量研究己經(jīng)證實(shí)，SREBPs在脂肪合成基因的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控中有著極其重要的作用［6－8］。

秦川牛是我國(guó)著名的地方黃牛品種，肉役性能突出，遺傳穩(wěn)定，適應(yīng)性強(qiáng)，但也同時(shí)存在生長(zhǎng)速度較慢、脂肪沉積能力較弱等不足之處［9］。大連雪龍黑牛是以遼寧本地黃牛為基礎(chǔ)，通過(guò)引進(jìn)利木贊和日本和牛進(jìn)行三元雜交而成的優(yōu)質(zhì)肉牛雜交組合［10］，其脂肪沉積能力強(qiáng)，肉質(zhì)鮮嫩，飽和脂肪酸低、膽固醇含量也低、不飽和脂肪酸高［11］。因此，揭示秦川牛與雪龍黑牛脂質(zhì)代謝的分子調(diào)控機(jī)制，可為應(yīng)用分子育種技術(shù)加快秦川牛的肉用選育和改良奠定基礎(chǔ)。

本研究利用qRT－PCR 檢測(cè)A－FABP基因和SREBP1基因在牛體內(nèi)不同組織中的表達(dá)特性，以及揭示這兩個(gè)基因在脂肪沉積能力存在顯著差異的秦川牛和雪龍黑牛脂肪、肌肉和肝臟組織中的表達(dá)差異，為優(yōu)質(zhì)肉牛品種的選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

國(guó)家肉牛改良中心種質(zhì)資源庫(kù)－80℃保存的3月齡荷斯坦牛心臟、脾臟、肝臟、肺、腎、肌肉、脂肪、瓣胃、網(wǎng)胃、皺胃、瘤胃、大腸、小腸等13種組織，用于分析A－FABP和SREBP1的表達(dá)規(guī)律。

3頭30月齡左右大連雪龍黑牛閹牛和3頭30月齡秦川牛閹牛肌肉、脂肪、肝臟用于比較AFABP和SREBP1在脂肪沉積能力存在顯著差異的肉牛中表達(dá)差異。

1.2 RT－PCR

1.2.1 不同品種牛組織總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol法提取組織RNA（按照說(shuō)明書(shū)操作），并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法和分光光度計(jì)檢測(cè)法進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。將符合要求的所提取的組織總RNA 用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（總體積40μL∶8μL PrimeScript RT Master Mix，2μg總RNA，用RNase free dH2O 補(bǔ)足40μl），反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃，15min；85 ℃，5s；4℃（反應(yīng)需在冰上進(jìn)行）。得到的cDNA 置于－20℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) PCR 擴(kuò)增所用引物全部根據(jù)GenBank 提供的有關(guān)mRNA 序列用PrimerPremier（5.0版）自行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 引物信息Table 1 Primers for genes

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù) 使用SYB?Premix Ex TaqⅡ試劑盒（TakaRa 公司產(chǎn)品）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)總體系為20μL，其中包括SYB?Premix Ex TaqⅡ10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ROX Reference Dye（50X）0.4μL，模板2μL，水6μL。在7500Real Time PCR儀（ABI公司產(chǎn)品）上進(jìn)行反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火34s，循環(huán)40次，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。溶解曲線程序?yàn)椋?5℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

首先將樣品設(shè)置相同的閾值線（應(yīng)用SPSS16.0軟件計(jì)算重復(fù)樣品間Ct均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差），本研究分別以：（1）荷斯坦牛的肝臟組織中目標(biāo)基因的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)。（2）用待測(cè)候選基因的Ct值減去對(duì)應(yīng)組織內(nèi)參基因GAPDH 的Ct值就得到每種組織的ΔCt值，選擇ΔCt值最大的秦川?；蚴茄埡谂＝M織作為標(biāo)準(zhǔn)。采用2－△△Ct方法處理數(shù)據(jù)［12］，分析得到（1）目標(biāo)基因A－FABP和SREBP1 在荷斯坦牛13種組織中的表達(dá)情況。（2）目標(biāo)基因A－FABP和SREBP1在秦川牛和雪龍黑牛脂肪、肌肉和肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量。具體公式為：

ΔCT1＝CTmean（對(duì)照組目標(biāo)基因）－CTmean（對(duì)照組GAPDH）

ΔCT2＝CTmean（待測(cè)組目標(biāo)基因）－CTmean（待測(cè)組GAPDH）

RQ ＝2－（ΔCT2－ΔCT1）＝2－△△CT

式中：mean代表均值；CTmean（對(duì)照組目標(biāo)基因）指的是對(duì)照組目標(biāo)基因的3個(gè)樣品的mRNA 平均表達(dá)量；CTmean（待測(cè)組目標(biāo)基因）指的是待測(cè)組目標(biāo)基因的3 個(gè)樣品的mRNA 平均表達(dá)量；RQ 值（Relative Quantification，相對(duì)定量）表示試驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組變化的倍數(shù)。所得到的的基因的相對(duì)表達(dá)量用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05則認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛A－FABP 和SREBP1基因的組織表達(dá)規(guī)律分析

以肝臟組織中目標(biāo)基因的表達(dá)量為參照，所有荷斯坦牛組織中目標(biāo)基因A－FABP相對(duì)表達(dá)量的分析結(jié)果見(jiàn)圖1，分析數(shù)據(jù)可得在3月齡荷斯坦牛13種組織中，A－FABP在脂肪組織中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織，在瘤胃，網(wǎng)胃，瓣胃和肺中有少許表達(dá)，其他組織幾乎不表達(dá)。

以肌肉組織中目標(biāo)基因的表達(dá)量為參照，所有荷斯坦牛組織中目標(biāo)基因SREBP1的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖1，分析數(shù)據(jù)可知在3月齡荷斯坦牛13種組織中，SREBP1在脂肪組織中表達(dá)量最高，在腎，瘤胃和脾臟中有少許表達(dá)，其他組織幾乎不表達(dá)。

2.2 A－FABP 基因在秦川牛、雪龍黑牛的肌肉、脂肪、肝臟中的組織表達(dá)規(guī)律分析

通過(guò)數(shù)據(jù)分析A－FABP基因在雪龍黑牛和秦川牛的肌肉、脂肪、肝臟中的相對(duì)表達(dá)量可知如（圖2），A－FABP基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達(dá)量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟（P＜0.05），而在脂肪組織中，秦川牛和雪龍黑牛表達(dá)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖1 荷斯坦牛A－FABP和SREBP1組織表達(dá)差異分析A.A－FABP 基因各組織表達(dá)結(jié)果；B.SREBP1基因各組織表達(dá)結(jié)果；1.肌肉；2.脂肪；3.肝臟；4.心臟；5.肺；6.腎；7.脾臟；8.瘤胃；9.網(wǎng)胃；10.瓣胃；11.皺胃；12.大腸；13.小腸Fig.1 A－FABP and SREBP1expression difference in tissues of Holstein cattleChart A displayed the A－FABP gene expression in different tissues；chart B for that of SREBP1gene.1.Muscle；2.Fat；3.Liver；4.Heart；5.Lung；6.Kidney；7.Spleen；8.Rumen；9.Reticulum；10.Omasum；11.Abomasums；12.Large intestine；13.Small intestine

圖2 － 基因在秦川牛和雪龍黑牛肌肉脂肪和肝臟組織中的表達(dá)比較＊表示差異顯著（P＜0.05），＊＊表示差異極顯著（P＜0.01）。下同。Fig.2 A－FABP expression difference in muscle，fat，liver in Qinchuan cattle and Snowdragon cattle＊ marked sighificout difference amons given data（P＜0.05）.The same as below.

2.3 SREBP1基因在秦川牛、雪龍黑牛的肌肉、脂肪、肝臟中的組織表達(dá)規(guī)律分析

SREBP1基因在雪龍黑牛和秦川牛的肌肉、脂肪、肝臟中的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3。通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，SREBP1基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達(dá)量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟，而在脂肪組織中，秦川牛表達(dá)量顯著高于雪龍黑牛表達(dá)量（P＜0.05）。

圖3 SREBP1基因在秦川牛和雪龍黑牛肌肉、脂肪和肝臟組織中的表達(dá)比較Fig.3 SREBP1expression difference in muscle，fat，liver in Qinchuan cattle and Snowdragon cattle

3 討論

我國(guó)養(yǎng)牛歷史悠久，而且具有十分豐富的牛品種資源。然而據(jù)調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)牛肉產(chǎn)量雖占世界第三，但出口量卻不及國(guó)際牛肉貿(mào)易量的1%［13］。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的牛肉中優(yōu)質(zhì)牛肉所占比重太小，在國(guó)際上缺乏競(jìng)爭(zhēng)力。值得人們關(guān)注的是現(xiàn)在的牛肉市場(chǎng)尤其是對(duì)口感鮮嫩多汁、大理石花紋豐富，并含有大量人體所需脂肪酸的優(yōu)質(zhì)高檔牛肉需求量與日俱增［14］。在亞洲，日本、韓國(guó)都育成了風(fēng)味獨(dú)特、肉質(zhì)細(xì)嫩、各具特色的和牛、韓牛，它們所產(chǎn)牛肉大理石花紋豐富，我國(guó)亟待解決的問(wèn)題是培育優(yōu)良的肉牛品種［15］。首先需關(guān)注我國(guó)肉牛品種的肉質(zhì)性狀改良進(jìn)程，而深層次探索與之相關(guān)的基因具有至關(guān)重要的意義。據(jù)目前研究證明A－FABP與SREBP1對(duì)調(diào)節(jié)脂肪代謝起著重要的作用。因而進(jìn)一步研究這兩種基因在脂肪代謝中的調(diào)節(jié)規(guī)律顯然有助于培育優(yōu)良的高檔牛肉品種。

A－FABP是脂結(jié)合蛋白超家族的成員［16］。FABPs家族的主要功能是與哺乳動(dòng)物的脂肪酸代謝有關(guān)［17］。目前對(duì)A－FABP基因的研究多數(shù)集中于對(duì)其分子結(jié)構(gòu)的研究上。而其在組織中相對(duì)表達(dá)量的差異主要在雞、鴨、豬上。例如，Armstrong等［18］對(duì)豬A－FABP基因的組織表達(dá)規(guī)律進(jìn)行差異分析，采用Real－Time PCR 方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFABP基因都只在脂肪組織中表達(dá)。王啟貴等［19］選擇周齡不同的雞的肝組織、腎臟組織、心臟組織、肺臟組織、脾臟組織、脂肪組織等15種組織，利用熒光定量PCR 和Northern blot 方法，檢測(cè)雞AFABP基因在上述組織中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFABP基因僅在雞脂肪組織中表達(dá)。李文娟等［20］以矮腳雞、白來(lái)航雞和北京油雞3種公、母不同和日齡各異的脂肪為材料，采用熒光定量PCR，檢測(cè)AFABP基因在所測(cè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的性別、不一樣的品種、不同的日齡對(duì)AFABP基因的表達(dá)量有顯著差異。張紅等［21］采用實(shí)時(shí)定量Real－Time PCR 法對(duì)鴨A－FABP基因在所采取的組織中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行差異分析。證實(shí)該基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，在心臟、肌胃、肝等組織中均有少許表達(dá)，而在其它組織中幾乎不表達(dá)。2009年，楊志剛等［22］對(duì)朗徳鵝的A－FABP基因的表達(dá)規(guī)律采用Real－Time PCR 方法檢測(cè)。研究表明，該基因在肝臟中的表達(dá)量最高，脂肪僅次于肝臟，腦組織中的表達(dá)量是所有組織中最少的一個(gè)組織。這些研究均證明A－FABP基因與脂肪的代謝有著密不可分的關(guān)系，但在不同的物種中該基因的表達(dá)量不同。本研究結(jié)果顯示A－FABP基因在荷斯坦牛脂肪組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織。

SREBP－1的作用主要包括調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，以及類(lèi)固醇和脂肪酸的合成過(guò)程。SREBP－1基因可以直接調(diào)節(jié)脂肪沉積，還可參與脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)水平的調(diào)控，間接調(diào)節(jié)脂肪的生成。目前對(duì)SREBP－1基因的研究也主要集中在豬、雞、兔上。例如，2001年，Gondret等使用Northern印跡法對(duì)SREBPmRNA 豬、雞、兔的組織中的表達(dá)量在進(jìn)行檢測(cè)分析，預(yù)測(cè)SREBP－1和SREBP－2這兩個(gè)基因在肝臟和脂肪這兩種組織間的相對(duì)表達(dá)量的高低［23］。SREBP－1 mRNA 在兔的肝臟以及脂肪組織中從表達(dá)水平上看幾乎保持在一個(gè)水平，在雞的脂肪組織中SREBP－1 mRNA 的表達(dá)水平比在肝臟中低了近乎3 倍左右［24］。除此之外，SREBP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在脂肪代謝性疾病研究中起著重要的作用［25］。本研究檢測(cè)SREBP－1基因在牛的組織中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)SREBP1基因在荷斯坦牛的所有組織中均有表達(dá)，但在脂肪組織中表達(dá)量最高。

秦川牛和雪龍黑牛的選育代表了我國(guó)肉牛育種中兩種主流方法，秦川牛采用本品種選育，保持了其耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)良特性，雪龍黑牛是采用雜交育種方式獲得優(yōu)質(zhì)肉牛雜交組合，其生長(zhǎng)速度以及脂肪沉積能力顯著高于秦川牛。本試驗(yàn)旨在通過(guò)這比較A－FABP和SREBP1基因在秦川牛和雪龍黑牛中的表達(dá)差異，從而為確定影響牛肉質(zhì)性狀的候選基因奠定良好地基礎(chǔ)。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A－FABP基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達(dá)量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟，而在脂肪組織中，秦川牛和雪龍黑牛表達(dá)量無(wú)顯著差異。SREBP1基因在雪龍黑牛肌肉和肝臟組織中的表達(dá)量顯著高于秦川牛的肌肉和肝臟，而在脂肪組織中，秦川牛表達(dá)量顯著高于雪龍黑牛表達(dá)量。研究結(jié)果均顯示A－FABP和SREBP1在脂肪中表達(dá)量最高，推測(cè)其在牛脂肪組織的脂質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)脂肪的沉積起到一定的調(diào)控作用，值得深入研究。

［1］孔保華，陶 菲，刁新平.中國(guó)肉牛產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)［J］.肉類(lèi)研究，2002，（1）：10－13.

［2］Ebert T，Hopf L M.Circulating adipocyte fatty acid binding protein is increased in chronic and acute renal dysfunction［J］.Nutrition，Metabolism and Cardiovascular Diseases，2014，4：1－8.

［3］葉滿紅，文 杰，曹紅鶴，等.脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白基因多態(tài)性與雞肉［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（6）：526－532.

［4］龔道清，張 紅，顧志良，等.鴨脂肪酸結(jié)合蛋白基因的克隆和序列多態(tài)性分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（3）：232－236.

［5］何 俊.鴨L－FABP和A－FABP基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性及其對(duì)脂肪代謝相關(guān)基因的影響［D］.浙江杭州：浙江大學(xué)，2013.

［6］Walker A K，Jacobs R L，Watts J L，et al.A conserved SREBP－1／phosphatidylcholine feedback circuit regulates lipogenesis in metazoans［J］.Cell，2011，147（4）：840－852.

［7］許會(huì)芬.山羊SREBP－1基因的超表達(dá)對(duì)脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（11）：1 306－1 316.

［8］徐 麗，朱 淼.SREBP1基因多態(tài)性與西門(mén)塔爾牛肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)性進(jìn)行了分析［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（9）：1 312－1 316.

［9］劉 波，陳 宏，藍(lán)賢勇.秦川牛及其雜種牛生長(zhǎng)性能及雜種優(yōu)勢(shì)研究［J］.中國(guó)畜牧雜志，2006（2）：2－3.

［10］Stoeckman A K，Towle H C.The role ofSREBP－1cin nutritional regulation of lipogenic enzyme gene expression［J］.J Biol Chem，2002，277（30）：27 029－27 035.

［11］柴新娥.雪龍黑牛的肉營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)及飼養(yǎng)管理措施［J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2012（11）：1 673－1 921.

［12］Liu Ling.Relative quantitative detection of HLA－G mRNA expression in patients with endometriosis by 2－△△CTmethod［J］.China Healthy Birth and Genetic Magazine，2007，15（9）：25－26.

［13］昝林森，趙春平，劉 揚(yáng)，等.中國(guó)肉牛產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、熱點(diǎn)透析與發(fā)展趨勢(shì)及對(duì)策［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2009，11（5）：1－5.

［14］張路培，袁崢嶸.中國(guó)高檔牛肉市場(chǎng)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)展望［J］.中國(guó)畜牧雜志，2012，48（4）：34－37.

［15］王曉磊.肉牛業(yè)困境亟待改變［J］.當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2009，（12）：57－60.

［16］Ockner R K，Manning J A，Poppenhausen R B.A binding protein for fatty acids in cytosol of intestinal mucosa，liver，myocsrdium and other tissues［J］.Science，1972，177：56－58.

［17］Martin G G，Danneberg H，Kumar L S，et al.Decreased liver fatty acid binding capacity and altered liver lipid distribution in mice lacking the liver fatty acid－binding protein gene［J］.J Biol Chem，2003，278（24）：21 429－21 438.

［18］Armstrong M K，Bernlohr D A，Strorch J et al.The purification and characterization of a fatty acid binding protein specific to pig adipose tissue［J］.Biochemistry，1990，267（2）：373－378.

［19］王啟貴.雞FABP基因克隆、表達(dá)特性及功能研究［D］.黑龍江哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［20］李文娟，李宏賓，文 杰，等.雞H－FABP和A－FABP基因表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，375（2）：417－423.

［21］張 紅.鴨A－FABP基因和H－FABP基因的克隆、表達(dá)和功能研究［D］.江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2006.

［22］楊志剛，葛文華，王 雷.A－FABP基因內(nèi)含子2多態(tài)性及A－FABP基因在鵝組織中的差異表達(dá)研究［J］.中國(guó)畜牧雜志，2009，45（17）：3－8.

［23］Gondret F，F(xiàn)erre P，Dugail I.ADD－1／SREBP－1is a major determinant of tissue differential lipogenic capacity in mammalian and avian species［J］.J Lipid Res，2001，42（1）：106－113.

［24］Yin L，Zhang Y，Hillgartner F B.Sterol regulatory elementbinding protein－1interacts with the nuclear thyroid hormone receptor to enhance acetyl－CoA carboxylase－alpha transcription in hepatocytes［J］.J Biol Chem ，2002，277（22）：19 554－19 565.

［25］吳妍霖，肖惠玲，王 濤，等.SREBP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在代謝性疾病研究中的應(yīng)用［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16（3）：72－74.