胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突細胞誘導(dǎo)特異性CTL能力的體外研究

陳 江 牟為民 邵曉東 王 迪 許文達 郭曉鐘

胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染樹突細胞誘導(dǎo)特異性CTL能力的體外研究

陳 江1牟為民2邵曉東1王 迪1許文達1郭曉鐘1

目的觀察人胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA電轉(zhuǎn)染樹突細胞(Dendritic Cell袁DC)體外激發(fā)抗—特異性細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力遙方法自6例胰腺癌患者外周血單核細胞中分離、培養(yǎng)DC遙使用電穿孔法將M iaPaCa-2細胞總RNA體外轉(zhuǎn)錄和PCR擴增的MUC1 mRNA轉(zhuǎn)染DC袁以未負載抗—的DC為對照遙采用實時定量PCR技術(shù)檢測各組DC中MUC1表達遙四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測轉(zhuǎn)染各組DC存活率變化曰混合細胞培養(yǎng)法評價各組DC體外刺激自體T淋巴細胞增殖能力曰ELISA法檢測各組DC體外激發(fā)抗—特異性CTL細胞因子釋放量遙結(jié)果M iaPaCa-2總RNA與MUC1mRNA分別轉(zhuǎn)染后48 h DC中目標抗—的相對表達量分別為37.24依3.17和34.53依2.02袁兩者比較無顯著差異(P>0.05)遙電轉(zhuǎn)染后96 h MiaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DC存活率降至60.81%袁低于MUC1mRNA單轉(zhuǎn)染時DC的存活率(80%左右)(P<0.05)遙轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2總RNA DC刺激自體T細胞增殖指數(shù)為8 432依611.25袁顯著高于MUC1單獨轉(zhuǎn)染組3 664依305.17(P<0.05)曰且轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2總RNA DC激發(fā)特異性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌水平亦顯著高于MUC1mRNA單獨轉(zhuǎn)染組(P<0.05)遙結(jié)論胰腺癌腫瘤細胞總RNA轉(zhuǎn)染的DC較單一胰腺癌相關(guān)抗—負載DC有更強的體外抗—特異性CTL激發(fā)能力。

樹突細胞曰RNA轉(zhuǎn)染曰胰腺腫瘤曰細胞毒性T淋巴細胞

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤袁多數(shù)病例在發(fā)現(xiàn)時已屬晚期袁手術(shù)治療及放、化療作用有限袁患者預(yù)后極差袁臨床迫切需要探索新的有效治療手段[1-2]遙近年來新興的腫瘤生物免疫治療技術(shù)對多種類型腫瘤均有顯著的治療作用[3-5]袁樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)是體內(nèi)功能最為強大的抗—遞呈細胞(antigen presenting cell,APS)袁能夠刺激并致敏栽淋巴細胞袁產(chǎn)生細胞毒性栽淋巴細胞(cytotoxic T lynphocytes,CTLs)袁啟動機體免疫應(yīng)答遙以DC為基礎(chǔ)構(gòu)建的腫瘤疫苗技術(shù)作為腫瘤生物治療的核心策略袁為胰腺癌的臨床治療開辟了新的思路遙本研究將人胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA電轉(zhuǎn)染DCs袁觀察其在體外誘導(dǎo)并激發(fā)抗—特異性CTL的能力袁為今后胰腺癌腫瘤細胞全抗—DC疫苗的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

材料與方法

一、一般材料及試劑

篩選2012年6月至2014年3月期間沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科收治的6例HLA-A2+晚期胰腺癌患者袁男性4例袁女性2例袁年齡35~65歲袁平均年齡50歲遙全部患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查(剖腹探查活檢4例袁細針穿刺活檢2例)證實為胰腺癌遙入選前未經(jīng)放、化療及免疫治療遙所有患者均簽署知情同意書袁并經(jīng)本院倫理委員會批準。

人胰腺癌細胞株M iaPaCa-2(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科實驗室)曰RPM I1640、小牛血清(Hyclone公司袁美國)袁rhGM-CSF、rhIL4、TNF琢(PeproTec公司袁美國)袁鼠抗人CD40、HLA-DR、CD83和CD86單抗(Santa-Cruz公司袁美國)袁TRIzol、MTT、DM—SO、Ficoll淋巴細胞分離液(Sigma公司袁美國)袁3H標記甲基胸腺嘧啶(中科院—子能所)袁IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌細胞因子檢測試劑盒(BD公司袁美國)袁Sensiscript RT Kit、QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司袁德國)曰熒光實時定量PCR儀(GE公司袁澳大利亞)。

二、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

參照文獻[6]方法袁通過Ficoll密度梯度離心法袁分離來自胰腺癌患者100m L外周血中的PBMCs袁貼壁1h后袁取出未貼壁的細胞另作培養(yǎng)備用遙貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h后更換新鮮培養(yǎng)液袁加入rhGMCSF(800 IU/mL)和rhIL-4(500 IU/m L)遙37益袁5% CO2袁培養(yǎng)5 d后加入TNF-琢(10 ng/m L)袁培養(yǎng)至7 d袁收集成熟DCs遙使用倒置顯微鏡和電鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)5~10 d DCs形態(tài)學(xué)變化遙用流式細胞儀分析DCs的特征性標志CD40、DC特征性成熟標志CD83、共刺激分子CD86以及MHC類分子HLA-DR等的表達水平。

三、M iaPaCa-2細胞總RNA提取和鑒定

收獲胰腺癌M iaPaCa-2細胞袁加入Trizol試劑1m L充分裂解袁5 m in后加入氯仿200L袁4益12 000 r/m in離心15m in袁加入異丙醇500L袁室溫放置20m in袁4益12000 r/m in離心15m in袁棄上清袁加入75%乙醇1 m L漩渦器震蕩混均袁4益12 000 r/ m in離心15min遙棄上清袁超凈臺晾干后溶于25L DEPC水遙分光光度計測定A260/A280值袁計算RNA純度和含量袁1%變性凝膠電泳測RNA完整性后-80益保存。

四、體外擴增MUC1mRNA及DCs的轉(zhuǎn)染

采用Primer prem ier 5.0軟件設(shè)計MUC1及次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine phosphor ribose transferase,HPRT)引物袁并經(jīng)GenBank驗證遙以HPRT基因作為校正目標基因表達的看家基因遙MUC1引物上游院5憶-TGA GTG ATG TGC-3憶、下游院5憶-CTG CCCGTAGTTCTT TCG-3憶曰擴增產(chǎn)物大小158 bp遙HPRT引物上游院5憶-GGT TCT CGG GGC ACC TCT-3憶、下游院5憶-TCG GCT TGA AAT GACCTA ATG-3憶袁擴增產(chǎn)物大小221 bp遙按Sen—siscriptRTKit說明袁將步驟三獲得的M iaPaCa-2細胞總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴增得到MUC1 cDNA袁而后以1g樣本為模板袁按照T7mMessagemMachine試劑盒說明于37益2~4 h體外轉(zhuǎn)錄、擴增為MUC1mRNA袁計算RNA純度、含量并測完整性后保存。

[7]的方法院取200L培養(yǎng)5 d的未成熟DCs細胞懸液加入2mm的電極杯袁分別加入20gM iaPaCa-2總RNA和MUC1mRNA遙調(diào)整電壓300 V袁間隔125 ms袁4個脈沖袁持續(xù)250ms進行電轉(zhuǎn)染遙電穿孔后立刻置入4益冰箱靜置10m in袁移入加有完全培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中袁37益、5%CO2培養(yǎng)0~96 h遙同時袁以未轉(zhuǎn)染RNA的mock-DC作為對照組。

五、RNA轉(zhuǎn)染后DC中MUC1表達檢測

收集1伊106個不同轉(zhuǎn)染組DCs袁用TRIzol法提取總RNA袁按照QuantiTect SYBRGreen PCR試劑盒說明袁行實時定量PCR反應(yīng)院95益起始變性15 m in袁94益變性20 s袁60益退火20 s袁72益延伸20 s袁共40個循環(huán)袁最后68益60 s中止反應(yīng)曰根據(jù)參考文獻[8]的方法袁用雙標準曲線法[(待測樣品目的基因濃度/待測樣品看家基因濃度)/(對照組目的基因濃度/對照組看家基因濃度)]袁對兩組DC內(nèi)的MUC1基因進行相對定量測定袁每個樣品重復(fù)2次袁取均值遙同時袁使用MTT法檢測DC存活率變化。

六、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外刺激自體T淋巴細胞增殖實驗

分別收集不同轉(zhuǎn)染組DCs袁調(diào)節(jié)細胞濃度為1伊105/mL作為刺激細胞袁分選并調(diào)節(jié)患者自體PBMCs中的懸浮T淋巴細胞袁濃度為1伊106/mL作為反應(yīng)細胞袁按照刺激與效應(yīng)細胞l:10袁l:20袁l:40和l:80比例加入到96孔板中袁終體積200L袁在37益袁5%CO2培養(yǎng)5 d袁收獲細胞前18 h加入3HTdR袁每孔1Ci遙以RPM I-1640培養(yǎng)基替代效應(yīng)細胞的4個孔做為對照組袁使用液閃爍儀檢測每分鐘脈沖數(shù)(CPM)。

七、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外激發(fā)抗—特異性CTL釋放細胞因子

以不同轉(zhuǎn)染組DCs為刺激細胞袁以患者自體T淋巴細胞為效應(yīng)細胞袁刺激與效應(yīng)細胞按l:10比例混合反應(yīng)14 d后袁應(yīng)用ELISA法袁按試劑盒操作說明書檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-酌水平遙細胞培養(yǎng)上清用試劑盒中樣本稀釋液稀釋50倍后檢測遙每樣本設(shè)2個復(fù)孔袁取平均值。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析袁計數(shù)資料以%表示袁采用字2檢驗曰計量資料以x依s表示袁采用student-t檢驗袁P約0.05時判定具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、DC的分離、培養(yǎng)和鑒定

DC經(jīng)體外分離、培養(yǎng)袁數(shù)量可達初始數(shù)量的10~15倍遙鏡下可見胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規(guī)則突起袁部分突起末端呈球狀膨大(見圖1)遙同時可見轉(zhuǎn)染目標RNA后成熟DC表面標志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86的表達均顯著升高袁見表1。

圖1 體外培養(yǎng)的胰腺癌患者外周血DC細胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(A院培養(yǎng)第5天光鏡伊200曰B院培養(yǎng)第7天成熟DC光鏡伊400)

表1 流式細胞學(xué)檢測未成熟和成熟DC表型特征(n=6)

二、RNA轉(zhuǎn)染組DC內(nèi)MUC1抗—的表達

實時定量PCR結(jié)果顯示袁分別來自6名患者的DCs經(jīng)RNA電轉(zhuǎn)染48 h袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs、體外擴增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs在RNA水平均可檢測到MUC1的陽性表達遙其中袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs內(nèi)MUC1相對表達量(37.24依3.17)與體外擴增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs內(nèi)目標抗—相對表達量(34.53依2.02)比較袁無明顯差異(P>0.05)曰但mock DCs內(nèi)MUC1mRNA的相對表達量僅為4.19依0.52袁遠低于各RNA轉(zhuǎn)染組(P<0.05)袁見圖2。

圖2 電轉(zhuǎn)染48h后MUC1抗—在不同RNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs內(nèi)的相對表達情況(n=6)

三、RNA轉(zhuǎn)染組DCs細胞存活率變化情況

MUC1單抗—mRNA轉(zhuǎn)染后0~96 h袁DCs存活率變化較小袁穩(wěn)定在80%左右袁而M iaPaCa-2細胞總RNA轉(zhuǎn)染后DCs存活率呈現(xiàn)時間依賴性降低袁96 h時DC存活率低至60.81%(P<0.05)袁見圖3。

圖3 RNA電轉(zhuǎn)染不同時間點DCs細胞存活率變化情況轉(zhuǎn)染后96 h袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs細胞存活率顯著低于MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs(*P<0.05)

四、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外刺激自體T淋巴細胞增殖實驗

以M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs、體外擴增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs作為刺激細胞袁各組細胞與自體T淋巴細胞混合培養(yǎng)袁結(jié)果顯示在DC:T=1:10時袁DC-M iaPaCa-2 totalRNA組DCs刺激自體T細胞增殖指數(shù)為8 432依611.25袁顯著高于DC-MUC1組3 664依305.17(P< 0.05)及Mock DC組257依32.16(P<0.05)曰且在DC:T=1:20時袁DC-M iaPaCa-2 total RNA組DCs刺激自體T細胞增殖指數(shù)為6152依153.03袁亦顯著高于DC-MUC1組2 376依130.01(P<0.05)及M ock DC組108依17.18(P<0.05)曰而當(dāng)DC:T=1: 40及1:80時袁DC-M iaPaCa-2 total RNA轉(zhuǎn)染組與DC-MUC1組刺激自體T細胞的增殖指數(shù)無顯著差異(P躍0.05)(圖4)。

圖4 不同RNA轉(zhuǎn)染組DC刺激自體T細胞增殖實驗

五、不同RNA轉(zhuǎn)染組DC體外激發(fā)抗—特異性CTL釋放細胞因子

M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs、體外擴增MUC1mRNA轉(zhuǎn)染組DCs及mock DCs均具有刺激抗—特異性CTL分泌Th1型細胞因子的能力袁但Mock DCs對CTLs的刺激作用較弱袁幾可忽略不計遙ELISA法檢測示袁在DC:T=1:10時袁M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DCs能激活自體特異性T細胞袁其誘導(dǎo)特異性CTL分泌的IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-酌水平袁顯著高于MUC1mRNA轉(zhuǎn)染的DCs組(P<0.05)(圖5)。

圖5 不同RNA轉(zhuǎn)染組DC刺激特異性CTLs分泌細胞因子情況

討論

免疫逃避是胰腺癌患者的常見事件袁而提高機體抗腫瘤免疫反應(yīng)可能是臨床治療胰腺癌的有力手段遙DC在免疫反應(yīng)進程中可捕獲、處理、提呈腫瘤細胞抗—袁引起初級和次級免疫反應(yīng)等特殊功能[9]遙使用不同的方法使之負載腫瘤抗—袁制備DC腫瘤疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗—特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答已成為近年來腫瘤免疫治療的研究熱點之一遙DC腫瘤疫苗的實質(zhì)是以特異性T細胞為基礎(chǔ)的細胞免疫袁有關(guān)胰腺癌DC疫苗構(gòu)建的一個關(guān)鍵問題在于選擇合適的腫瘤抗—遙胰腺癌缺乏特異性腫瘤抗—、異質(zhì)性大、免疫—性差袁使用單腫瘤抗—負載DC構(gòu)建胰腺癌腫瘤疫苗時袁其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)通常較弱曰而使用腫瘤全抗—負載DC構(gòu)建胰腺癌疫苗則可激活針對不同腫瘤特異性抗—的多克隆細胞袁減少腫瘤細胞克隆變異引起的抗—缺失袁從而可以減少免疫逃逸的發(fā)生率袁理論上是一種較具優(yōu)勢的DC腫瘤疫苗的構(gòu)建方法[10]。

MUC1是高糖基化玉型糖蛋白的一種袁其蛋白分子較易被免疫細胞所呈遞和識別[11]遙同時袁MUC1的表達具有高度的腫瘤特異性袁在胰腺癌細胞中的陽性表達率可達90%以上袁因此被認為是胰腺癌免疫治療的一個重要靶點[12]遙本研究引入MUC1作為研究對象的目的在于院MUC1基因穩(wěn)定內(nèi)嵌在胰腺癌腫瘤細胞全抗—標志物袁檢測胰腺癌全腫瘤抗—負載后其在DC中的相對表達數(shù)量及效率袁即可間接判定腫瘤全抗—負載的多少與效率[13]。

RNA電轉(zhuǎn)染法具有操作簡單、安全、不受MHC遺傳背景影響等優(yōu)點[14]遙我們的研究發(fā)現(xiàn)袁利用RNA電轉(zhuǎn)染技術(shù)袁胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA可成功負載DC袁且轉(zhuǎn)染過程中未出現(xiàn)抗—不良交互反應(yīng)遙MUC1標志物抗—在轉(zhuǎn)染M iaPaCa-2總RNA組和MUC1mRNA組DCs中均有陽性表達袁且此兩RNA轉(zhuǎn)染組DCs內(nèi)MUC1的相對表達水平無顯著差別遙這一現(xiàn)象說明袁與經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄、擴增的單腫瘤抗—RNA轉(zhuǎn)染相比較袁胰腺癌細胞總RNA轉(zhuǎn)染在抗—負載能力及效率方面袁并不落下風(fēng)遙MUC1單抗—RNA轉(zhuǎn)染0~96 h袁DC存活率穩(wěn)定在80%左右袁而胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC后袁細胞存活率在不同的時間點明顯降低遙此現(xiàn)象可能與DC轉(zhuǎn)染的RNA劑量過多引起的毒性增加有關(guān)。

本實驗研究中袁我們將M iaPaCa-2細胞總RNA轉(zhuǎn)染組及MUC1mRNA單獨轉(zhuǎn)染組DCs與自體T細胞混合培養(yǎng)袁結(jié)果顯示在不同效靶比情況下袁不同RNA轉(zhuǎn)染組DCs均能刺激自體T細胞增殖曰但M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染組DC對自體T細胞的增殖刺激能力顯著高于MUC1mRNA單獨轉(zhuǎn)染組DC袁提示隨著負載抗—表位的增加袁DC刺激自體T細胞增殖的能力亦可顯著增強遙DC腫瘤疫苗的最終目的在于其誘導(dǎo)體內(nèi)CTL反應(yīng)袁進而對腫瘤細胞產(chǎn)生特異性的殺傷效應(yīng)遙隨著T細胞的增殖和特異性CTL的擴增袁活化的CTL可分泌大量Th1型的細胞因子如IL-2、IL-10、Granzyme B和IFN-酌等袁故而DC對體外CTL的刺激活化能力可間接使用IFN-酌等細胞因子的釋放量表示[15]遙本研究發(fā)現(xiàn)袁M iaPaCa-2細胞總RNA轉(zhuǎn)染組及MUC1 mRNA單獨轉(zhuǎn)染組DCs均具有體外激發(fā)CTL的能力袁但M iaPaCa-2總RNA轉(zhuǎn)染可使DCs表現(xiàn)出較單抗負載時更強的CTL激發(fā)效應(yīng)遙此發(fā)現(xiàn)與Van Tendeloo等的研究結(jié)果[16]類似遙提示DC體外激發(fā)特異性CTL的能力可能與其所負載抗—表位的數(shù)目有關(guān)袁而與轉(zhuǎn)染RNA的劑量無關(guān)遙即隨著DC負載的抗—表位數(shù)量的增加袁其體外活化、激發(fā)抗—特異性CTL的能力亦會顯著增強。

綜上所述袁本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了人胰腺癌M iaPaCa-2細胞總RNA的DCs可在體外顯著促進抗—特異性CTL的增殖和活化袁此結(jié)果為胰腺癌腫瘤細胞全抗—DC疫苗的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了部分理論和實驗基礎(chǔ)。

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The induction of specific cytotoxic T lymphocytes by the dendritic cells transfected with total RNA of pancreatic cancer M iaPaCa-2 cells in vitro

CHENJiang1,MUWei-min2,SHAO Xiao-dong1,WANGDi1, XUWen-da1,GUOXiao-zhong1.1)
DepartmentofGastroenterology,Shenyang General Hospital ofPeople憶s Liberation Army,Shenyang,110840,China;2)Departmentof Gastroenterology,No.222 HospitalofPeople憶s Liberation Army,Jilin,132011,China.Corresponding author:GUO Xiao-Zhong,E-mail:Guoxi—aozhong1962@aliyun.com

Objective To investigate the ability of induction of specific cytotoxic T lymphocytes(CTL) stimulated by dendritic cells(DC)transfectedw ith total RNA of human pancreatic cancerM iaPaCa-2 cell lines.M ethod DCswere isolated and cultured from peripheral bloodmononuclearcells(PBMCs).Total RNA derived from MiaPaCa-2 cell lines and MUC1mRNA were transfected into DCs by electroporation respec—tively.The expression of MUC1 in DCswas detected by quantitative real-time PCR.The survival rate of transfected DCswere determined by MTT method.The lymphocyte proliferation ability was evaluated by m ixed cell culturemethod.The cytokinesreleasing of antigen-specific CTLsweremeasured by ELISA assay. Results A fter totalRNA ofMiaPaCa-2 cell linesand MUC1 mRNA transfection for 48h,the expression of MUC1 were 37.24依3.17 and 34.53依2.02(P>0.05).After MUC1mRNA was individually transfected,the survival rate of DCsw as stabilized around 80%,and the survival rate of DCswas 60.81%96 hoursafter the totalRNA ofMiaPaCa-2 cell lines transfection(P<0.05).Theautologous T cell proliferation index of the to—talRNA ofMiaPaCa-2 cell lines transfectionwas 8,432依611.25 in DC group,whichwassignificantly higherthan the single MUC1 transfection group(3,664依305.17)(P<0.05).The levelsof IL-2,IL-10,Granzyme B,IFN-酌secretedby MUC1 and the total RNA ofM iaPaCa-2 cell line transfected DC-specific CTL were significantly higher than MUC1m RNA alone transfection group(P<0.05).Conclusion DCs transfectedw ith the total RNA of pancreatic cancer M iaPaCa-2 cell lineshave a stronger ability to stimulate specific CTL in vitro than the single antigen loaded DCs.

Dendriticcells;RNA transfection;Pancreatic cancer;Cytotoxic T lymphocytes

院2014-06-12)

(本文編輯院郭文)

DOI院10.3969/j.issn.1672-2159.2014.05.008

院1 110016沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化科曰2 132011解放軍222醫(yī)院消化科

院郭曉鐘袁E-mail:Guoxiaozhong1962@163.com

院國家自然科學(xué)基金資助項目(81071982)