動物基因是如何轉(zhuǎn)移的？

冬雪

通過基因工程技術(shù)把外源性目標(biāo)基因?qū)肽撤N受體動物的生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在其染色體上穩(wěn)定整合，之后經(jīng)過各種發(fā)育途徑把外源性基因傳遞到子代，這就是動物的轉(zhuǎn)基因，或稱轉(zhuǎn)基因動物。

外源性基因?qū)胧荏w動物有不同的方法，同時，由于有不同的受體動物，因此要根據(jù)實際情況采用不同的方法對動物進行轉(zhuǎn)基因。大致而言，動物轉(zhuǎn)基因的方法有：逆轉(zhuǎn)錄病毒法、顯微注射法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、精子載體法和體細(xì)胞核移植法（體細(xì)胞克隆介導(dǎo)法）等。

通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移基因

研究人員早就發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒常常能侵入宿主細(xì)胞并整合于細(xì)胞中的DNA，因此逆轉(zhuǎn)錄病毒被用來當(dāng)成載體以進行外源性基因的轉(zhuǎn)移。一般做法是，把外源性基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒，再由逆轉(zhuǎn)錄病毒感染受體動物的胚胎。此后將感染的桑椹期胚胎導(dǎo)入動物子宮，就可發(fā)育成攜帶外源性基因的子代動物。

具體的原理是，逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下會反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA，然后整合到受體細(xì)胞核基因組中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的長末端重復(fù)序列（LTR）區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動子活性，如果把外源基因連接到LTR下部進行重組后，包裝成高滴度病毒顆粒，加入到動物早期胚胎的培養(yǎng)液中，或與胚胎共同培養(yǎng)，或注入囊胚腔中，攜帶外源性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA就可以整合到宿主染色體上，達到外源性基因轉(zhuǎn)移到受體動物胚胎的目的。

2001年，美國哥倫比亞大學(xué)的帕克等人利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將綠色熒光蛋白（EGFP）基因轉(zhuǎn)入豬的成纖維細(xì)胞和耳上皮細(xì)胞，然后用這些細(xì)胞的細(xì)胞核進行核移植，獲得了能發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)基因豬。與此同時，其他研究人員利用這種方法培育出轉(zhuǎn)基因猴。

但是，逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體具有潛在的致癌性，而且載體的構(gòu)建較為復(fù)雜，容納外源性基因的大小也有限，因此這項技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制。

顯微注射法轉(zhuǎn)移基因

動物轉(zhuǎn)基因的顯微注射法又稱受精卵原核顯微注射法，是用直徑約0.5～1微米的玻璃微管吸入外源性基因，直接插入到受體動物的受精卵的細(xì)胞內(nèi)，將外源性基因注入細(xì)胞中，然后通過受體動物基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等，使外源性基因嵌入受體動物的染色體內(nèi)，最后這樣的胚胎移植到代孕母體子宮內(nèi)并發(fā)育成子代個體。

1980年美國的戈登等人首先用顯微注射法創(chuàng)造了轉(zhuǎn)基因小鼠。他們把小鼠的受精卵取出來，在顯微鏡下將胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的細(xì)胞中，然后將受精卵輸入代孕母鼠的子宮內(nèi)，最終發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠。此后研究人員相繼把人的珠蛋白基因和胰島素基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)。

顯微注射法的優(yōu)點是，動物的任何外源性基因都可轉(zhuǎn)入受體動物體內(nèi)，而且用這種方法已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠、魚、大鼠、兔子以及轉(zhuǎn)基因牛、羊、豬等。但是，這種方法轉(zhuǎn)移外源性基因到受體動物的染色體時是隨機整合的，因而難以控制其整合率。另外對外源性基因能否穩(wěn)定整合于受體基因組的檢測必須等到子代個體出生后才能進行和確認(rèn)，不利于在生育期長、產(chǎn)仔少的大家畜中應(yīng)用。

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

胚胎干細(xì)胞（ES）是從哺乳動物囊胚期內(nèi)的細(xì)胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細(xì)胞，具有發(fā)育的多能性，能夠分化出各種組織。20世紀(jì)80年代中期研究人員就開始利用胚胎干細(xì)胞進行動物轉(zhuǎn)基因。方法是，將外源性基因直接導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體胚胎，與其中的胚胎細(xì)胞聚集在一起，成為受體胚胎的一部分，參與其分化。

此后，這種胚胎可發(fā)育成嵌合體的轉(zhuǎn)基因動物，這種動物體內(nèi)有一部分組織來源于整合有外源性基因的供體胚胎干細(xì)胞。在嵌合過程中，從胚胎干細(xì)胞分化而成的生殖細(xì)胞可通過雜交將轉(zhuǎn)入的外源性基因傳遞到子代。

研究證明，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法可使受體動物細(xì)胞中外源性基因整合率達50%，其中生殖細(xì)胞中外源性基因整合率可達30%。但是，建立胚胎干細(xì)胞系比較困難，現(xiàn)在只建立了小動物的胚胎干細(xì)胞系，豬、羊、牛等大型動物的胚胎干細(xì)胞系尚未建立。

精子載體法

早在1971年，研究人員就發(fā)現(xiàn)，外源性基因可以進入動物精子。后來，研究人員將精子反復(fù)冷凍或經(jīng)化學(xué)物質(zhì)處理后與外源性基因共同孵育，使外源性基因與精子結(jié)合，通過人工授精獲得轉(zhuǎn)基因個體。

1989年，意大利研究人員拉維特拉諾將小鼠附睪精子與線粒體或環(huán)狀pSV2CAT質(zhì)粒一起在37℃下孵育30分鐘，再用這種精子對成熟卵子進行體外授精，這樣得到胚胎移植入受體鼠的子宮孕育，通過受體鼠孕育產(chǎn)出250只小鼠，以CAT基因為標(biāo)記進行檢測，發(fā)現(xiàn)有30%的小鼠成為轉(zhuǎn)基因鼠。

目前研究人員通過精子載體法已獲得了12種轉(zhuǎn)基因動物，如轉(zhuǎn)基因牛、豬、家兔和小鼠等。但是，這種方法進行動物轉(zhuǎn)基因的成功率不高，效果也不穩(wěn)定，還有待進一步研究和發(fā)展。其中，必須弄清楚精子和外源性基因結(jié)合的分子機制，外源性基因在精子和受精卵內(nèi)的復(fù)制機理，以及促進精子結(jié)合外源性基因的方法和途徑。

體細(xì)胞核移植法

體細(xì)胞核移植法又稱體細(xì)胞克隆介導(dǎo)法，原理是，將外源性基因?qū)雱游矬w細(xì)胞染色體中，然后通過顯微操作技術(shù)將轉(zhuǎn)入了外源性基因的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中構(gòu)成一個重建卵子，然后用人工方法讓這個卵子發(fā)育，形成胚胎，再把胚胎移植到受體動物中，經(jīng)妊娠、分娩后獲得轉(zhuǎn)基因克隆動物。

利用體細(xì)胞核移植法是目前動物轉(zhuǎn)基因中的高級技術(shù)，1997年世界上第一個轉(zhuǎn)基因綿羊（克隆羊）多利就是用這種方法產(chǎn)生的，是英國PPL公司與羅斯林研究所率先應(yīng)用體細(xì)胞核移植法獲得的成果。

多利誕生的過程和原理可以詳細(xì)解釋體細(xì)胞核移植法進行的動物轉(zhuǎn)基因。

研究人員先從一只6歲的芬蘭多塞特雌性白面綿羊（簡稱A）的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止分裂，這個細(xì)胞稱為供體細(xì)胞。此后，研究人員從一頭蘇格蘭黑面雌性綿羊（簡稱B）的卵巢中取出未受精的卵子，并將細(xì)胞核去除，使這個卵子成為一個無細(xì)胞核的卵細(xì)胞，也稱為受體細(xì)胞。

然后，研究人員利用電脈沖方法讓供體細(xì)胞和受體細(xì)胞融合，在這個過程中A細(xì)胞的細(xì)胞核融入B細(xì)胞中并像受精卵一樣產(chǎn)生細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎。最后將這個胚胎移植到另一只蘇格蘭黑面雌性綿羊（簡稱C）的子宮內(nèi)，胚胎正常發(fā)育，足月孕育后綿羊C娩出小綿羊多利。

從這個過程可以看出，多利的主要遺傳物（細(xì)胞核DNA）來自多塞特雌性白面綿羊（A），當(dāng)然，多利身上還有來自蘇格蘭黑面雌性綿羊（B）的線粒體DNA，因為B細(xì)胞盡管去除了細(xì)胞核，在其細(xì)胞質(zhì)中還有多種細(xì)胞器，其中就含有線粒體，線粒體也是一種遺傳物質(zhì)。所以，多利有3位母親，一是基因母親多塞特白面母綿羊（A）；第二個是借卵母親，也稱線粒體母親，即剔除了細(xì)胞核的蘇格蘭黑面綿羊（B），胚胎是在B的卵子中借殼融合、分裂、發(fā)育而成的；第三個是代孕母親，即另一頭蘇格蘭黑面雌性綿羊（C），多利是在綿羊C的子宮中孕育并分娩的。

從這個意義上看，這樣的轉(zhuǎn)基因?qū)嶋H上轉(zhuǎn)移了多塞特雌性白面綿羊（A）的全部細(xì)胞核的基因組。由于多利沒有父親，是通過無性繁殖即克隆而來，因此這樣的轉(zhuǎn)基因方法也稱為體細(xì)胞克隆介導(dǎo)法。

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