高效液相色譜法定量分析固態(tài)發(fā)酵食醋中有機酸的方法優(yōu)化

余永建，鄧曉陽，陸震鳴,2，史勁松,3，許正宏,2,3,*

（1.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津 300308；3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000）

高效液相色譜法定量分析固態(tài)發(fā)酵食醋中有機酸的方法優(yōu)化

余永建1，鄧曉陽1，陸震鳴1,2，史勁松1,3，許正宏1,2,3,*

（1.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，天津 300308；3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000）

優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵食醋中9種有機酸的高效液相色譜定量分析方法。色譜條件：以C18色譜柱進行分離，流動相為NaH2PO4溶液，流速為0.9 mL/min，檢測波長為210 nm，可在14 min內(nèi)完成檢測。在優(yōu)化的色譜條件下，9種有機酸的檢測線性范圍較寬，最低檢出限為0.02～1.79 mg/L，加標回收率為96.02%～104.55%，相對標準偏差0.46%～3.52%。該方法具有靈敏、準確、穩(wěn)定等優(yōu)點，可用于固態(tài)發(fā)酵食醋中有機酸的測定。

固態(tài)發(fā)酵食醋；高效液相色譜；有機酸

中國傳統(tǒng)固態(tài)釀造食醋具有悠久的歷史，是深受我國人民喜愛的一種調(diào)味品[1-4]。固態(tài)發(fā)酵食醋中有機酸種類豐富，除乙酸外尚存在乳酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸等多種不揮發(fā)酸，對食醋的口感具有重要影響[5-7]。例如，琥珀酸可增強醋的鮮味，乳酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等可以緩沖乙酸的刺激性，使醋液酸味柔和、醇厚[8]。食醋中有機酸主要來源于固態(tài)釀造過程中各種微生物的代謝活動，且不同釀造原料（高粱、糯米、麩皮等多種谷物）和工藝生產(chǎn)條件所產(chǎn)出的食醋中有機酸組成差別較大[9-12]。因此，準確測定食醋中有機酸的種類和含量對于評價食醋品質(zhì)及解析食醋釀造機理具有重要意義。

目前用于食醋有機酸定量分析的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、離子排斥色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法[13-17]，其中HPLC法由于具有高效快速、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點使用最為普遍。已有學者采用HPLC法對不同地域發(fā)酵食醋的有機酸組成進行了分析[18-19]，對食醋發(fā)酵過程中有機酸的變化規(guī)律進行了研究[20-21]。但是目前對食醋中復雜有機酸組成的HPLC分析條件優(yōu)化及其方法學評價的研究報道較少。另外，食醋中除了富含有機酸以外，尚含有大量蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)以及色素等小分子物質(zhì)。這些物質(zhì)的存在容易導致食醋有機酸HPLC分析過程中柱壓升高、使用壽命降低、有機酸分離度下降等問題。前期已對有機酸HPLC分析前的食醋樣品預處理方法（沉淀、固相萃取）進行了優(yōu)化[15]，本研究進一步對經(jīng)過預處理后的醋樣中9種有機酸的HPLC分析條件進行了優(yōu)化及方法學評價，為固態(tài)發(fā)酵食醋中有機酸定量分析及其釀造機理解析提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固態(tài)發(fā)酵醋樣為鎮(zhèn)江香醋，總酸4.5 g/100 mL，主要生產(chǎn)原料為糯米和麩皮，生產(chǎn)日期為2012年4月。

磷酸、磷酸二氫鈉、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、乙酸（均為分析純）、甲醇（色譜純） 中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司；草酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸和蘋果酸（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

有機酸標準溶液（0.50 mg/mL草酸、1.00 mg/mL酒石酸、0.51 mg/mL丙酮酸、0.50 mg/mL α-酮戊二酸、4.02 mg/mL乳酸、10.05 mg/mL乙酸、0.50 mg/mL檸檬酸、0.50 mg/mL焦谷氨酸、1.00 mg/mL琥珀酸） 中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-25C型pH計 上海鵬順科學儀器有限公司；EL204型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；U3000高效液相色譜儀 美國Dionex公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 食醋樣品的預處理[22]

取5 mL醋樣于100 mL容量瓶中，加入2 mL 10.6%（m/m）亞鐵氰化鉀溶液和2 mL 30%（m/m）硫酸鋅溶液，搖勻后用超純水定容，靜置0.5 h后用雙層濾紙過濾，濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后采用Sep-Pak C18固相萃取小柱處理（小柱用5 mL甲醇進行活化，然后用5 mL超純水平衡），將樣品溶液緩慢流過小柱，流速1 mL/min，所得溶液用于HPLC分析。

1.3.2 HPLC分析條件的優(yōu)化

色譜柱：Waters Atlantis T3（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：分別對9種有機酸的標準溶液進行全波長掃描（190～400 nm），確定樣品的檢測波長；流動相：比較3種磷酸鹽溶液（NaH2PO4、KH2PO4、 (NH4)2HPO4）在不同濃度（0.01、0.02、0.03 mol/L）、不同pH值（2.3、2.5、2.7、2.9、3.1，用H3PO4調(diào)節(jié)）、不同柱溫（25、30、35、40 ℃）以及流速（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min）條件下對食醋有機酸保留時間和分離度的影響；進樣量10 μL。

1.3.3 HPLC分析方法的驗證

1.3.3.1 線性關系

取不同體積（0.0、0.1、0.2、0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mL）的有機酸標準溶液，用超純水定容于10 mL容量瓶中，混勻后分別進行HPLC分析。繪制峰面積-質(zhì)量濃度標準曲線，計算各有機酸的線性范圍、回歸方程及相關系數(shù)，并以信噪比RSN=3對應的質(zhì)量濃度確定各有機酸的檢出限。

1.3.3.2 精密度

1 d內(nèi)連續(xù)6次對同一有機酸標樣進行HPLC分析，測定各有機酸的保留時間和峰面積，計算精密度（以相對標準偏差表示）。

1.3.3.3 準確度

取同一醋樣2份（5.0 mL），其中1份作為本底，另1份加入有機酸標準溶液5 mL，分別預處理后進行HPLC分析，計算各有機酸的加標回收率。

1.3.3.4 重復性

取同一醋樣6份（5.0 mL），分別預處理后進行HPLC分析，計算相對標準偏差。

1.3.3.5 穩(wěn)定性

取5.0 mL醋樣進行預處理，分別在制樣不同時間后（0、2、4、8、12、24 h）進行HPLC分析，計算相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

本研究分別對9種有機酸在190～400 nm進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)各種有機酸在210 nm波長處均有較大的吸收峰，故采用210 nm作為醋樣中9種有機酸的檢測波長，此結(jié)果與趙景嬋等[23]報道一致。

2.2 流動相的選擇

磷酸鹽緩沖溶液在紫外區(qū)幾乎無吸收，是有機酸分析最常用的的流動相[17]。本研究中比較了不同緩沖液作為流動相時，9種有機酸的分離情況。結(jié)果表明，上述3種磷酸鹽緩沖溶液對9種有機酸的出峰順序和分離效果無顯著性差異。但是NaH2PO4緩沖液作為流動相時，有機酸的分析時間最短（＜17 min），而另外2種緩沖液則需要20 min完成所有有機酸的分析，故選擇NaH2PO4溶液為本實驗的流動相。

2.3 流動相濃度的選擇

圖1 不同緩沖液濃度對9種有機酸保留時間的影響Fig.1 Effect of buffer concentration on retention time

由圖1可知，磷酸鹽緩沖溶液的濃度直接影響其緩沖容量、在流動相中的存在形式及溶液的離子強度，從而影響有機酸在色譜柱上的分離效果。緩沖溶液的濃度越高，待測有機酸的存在形式越穩(wěn)定，但緩沖溶液的濃度不能過高，因為其濃度增高時，離子強度也增大，對組分分離不利，同時影響泵和柱子的壽命，增加流動相的本底吸收，降低測定的靈敏度[23]。本實驗中NaH2PO4溶液濃度為0.01 mol/L時，α-酮戊二酸和乳酸不能分開，而流動相濃度為0.02、0.03 mol/L時，有機酸均能得到有效分離（圖1）?？紤]到高鹽濃度對泵和柱子的不利影響，本實驗選用0.02 mol/L NaH2PO4溶液作為流動相。

2.4 流動相pH值的選擇

圖2 流動相的pH值對保留時間的影響Fig.2 Effect of mobile phase pH on retention time

由圖2可知，當pH值為2.3時，α-酮戊二酸和乳酸不能分開，檸檬酸和焦谷氨酸沒有分開；pH值為2.5時，檸檬酸和焦谷氨酸仍然沒有完全分開；逐步提高pH值，各酸的保留時間提前，9種有機酸逐漸得到分離，但草酸和酒石酸、檸檬酸和乙酸的分離度卻逐漸減??；當pH值為3.1時，檸檬酸與乙酸的色譜峰重疊。因此，最終確定最適流動相pH值為2.7。

2.5 柱溫的選擇

根據(jù)色譜理論，柱溫是影響柱效和分離度的主要因素，柱溫升高可以降低流動相的黏度、提高傳質(zhì)效率[18]，降低保留時間，但柱溫太高不利于有機酸的分離且影響色譜柱的使用壽命。本實驗結(jié)果表明，25 ℃時檸檬酸和焦谷氨酸分離不佳；隨著色譜柱溫度的升高，各有機酸的保留時間均提前，尤其是琥珀酸、焦谷氨酸和檸檬酸；當溫度為40 ℃時，乙酸和檸檬酸不能完全分離（圖3）。綜合考慮有機酸的保留時間與分離度，最終將色譜柱溫度定為35 ℃。

圖3 柱溫對保留時間的影響Fig.3 Effect of column temperature on retention time

2.6 流速的選擇

實驗結(jié)果表明，流速在0.5～1.0 mL/min范圍內(nèi)有機酸的分離效果相差不大；流速越低，保留時間越長。綜合考慮流速對保留時間、色譜柱壓力的影響，本實驗選擇流速為0.9 mL/min，9種有機酸能在14 min內(nèi)完成分析，此時系統(tǒng)壓力適中，靈敏度也足夠高。

2.7 線性范圍和檢出限

將不同質(zhì)量濃度的有機酸標準溶液進行HPLC分析，以峰面積外標法定量，繪制各有機酸的峰面積-質(zhì)量濃度曲線，得到9種有機酸回歸方程及相關系數(shù)，并以3倍噪聲對應的質(zhì)量濃度計算出各有機酸的最低檢出限，結(jié)果見表1。有機酸的峰面積與進樣質(zhì)量濃度呈良好的線性關系，且線性范圍寬、檢出限較低，表明此方法靈敏度較高。

表1 有機酸標準曲線的線性參數(shù)Table 1 Regression equations and correlation coefficients for organic acids

2.8 精密度

本實驗中各有機酸峰面積的相對標準偏差為0.16%～2.38%（表2），說明該方法的精密度較好。

表2 測定方法的精密度Table 2 Precision of the method mAU

2.9 準確度

表3 有機酸加標回收率Table 3 Recovery of organic acids

由表3可知， 9種有機酸的加標回收率在96.02%～104.55%之間，說明該方法的準確度較高。

2.10 重復性

表4 測定方法的重復性Table 4 Repeatability of the method mg/mL

由表4可知，有機酸重復實驗的相對標準偏差在0.46%～3.52%之間，說明本方法的重復性比較好。

2.11 穩(wěn)定性

由表5可知，樣品在24 h內(nèi)各有機酸的質(zhì)量濃度無顯著差異，相對標準偏差為0.95%～4.17%，說明樣品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表5 測定方法的穩(wěn)定性Table 5 Stability of the method mg/mL

2.12 典型食醋樣品的分析

經(jīng)過單因素優(yōu)化后獲得了最優(yōu)HPLC分析條件：以C18色譜柱進行分離，柱溫35℃，流動相為0.02 mol/L NaH2PO4溶液pH 2.7，流速0.9 mL/min，檢測波長210 nm，整個分析可在14 min內(nèi)完成。采用優(yōu)化后的分析方法獲得的典型食醋樣品和有機酸標樣的HPLC分析圖譜見圖4。

圖4 有機酸標樣（a）和典型食醋樣品（b）有機酸HPLC分析的圖譜Fig.4 Chromatograms of organic acid standards (a) and typical solid-state fermented vinegar (b)

3 結(jié) 論

本實驗對固態(tài)發(fā)酵食醋有機酸的HPLC分析條件進行了優(yōu)化，獲得了最優(yōu)色譜條件：以C18色譜柱進行分離，柱溫35 ℃，流動相為0.02 mol/L NaH2PO4溶液（pH 2.7），流速0.9 mL/min，檢測波長210 nm，整個分析可在14 min內(nèi)完成。該方法的線性關系良好，且準確度、靈敏度、精密度較高，重復性好，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于固態(tài)發(fā)酵食醋中有機酸的定量分析。

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An Optimized Method for the Analysis of Organic Acids in Solid-State Fermented Vinegars by High Performance Liquid Chromatography

YU Yong-jian1, DENG Xiao-yang1, LU Zhen-ming1,2, SHI Jin-song1,3, XU Zheng-hong1,2,3,*
(1. School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China; 3. National Engineering Research Center of Solid-State Brewing, Luzhou 646000, China)

Quantitative determination of 9 organic acids in traditional Chinese vinegars by high performance liquid chromatography (HPLC) was optimized. The procedure of HPLC analysis was carried out on a C18column using sodium dihydrogen phosphate as the mobile phase. The flow rate was 0.9 mL/min and the detection wavelength was 210 nm. The HPLC analysis was completed within 14 min. The linear ranges for 9 types of organic acids were wide and the limits of detection were 0.02–1.79 mg/L. The recovery rates were in the range of 96.02%–104.55% with relative standard deviation (RSD) of 0.46%–3.52%. This method is sensitive, accurate, repeatable and suitable for the determination of organic acids in traditional Chinese vinegars.

solid-state fermented vinegar; high performance liquid chromatography; organic acids

TS207.3

A

1002-6630（2014）04-0055-05

10.7506/spkx1002-6630-201404012

2013-05-04

國家自然科學基金面上項目（31271922）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA021301；2013AA102106）；國家固態(tài)釀造工程技術研究中心開放課題（2011B2211；GCKF201109）

余永建（1976—），男，博士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：1439878431@qq.com

*通信作者：許正宏（1976—），男，教授，博士，研究方向為生物工程。E-mail：zhenghxu@jiangnan.edu.cn