響應(yīng)面法優(yōu)化梅花鹿胎盤多肽超聲波殺菌工藝

皮鈺珍，關(guān)楚諭，孫文華，岳喜慶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110086）

響應(yīng)面法優(yōu)化梅花鹿胎盤多肽超聲波殺菌工藝

皮鈺珍，關(guān)楚諭，孫文華，岳喜慶

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110086）

以酶解獲得的梅花鹿胎盤多肽為原料，進行超聲波殺菌，研究超聲功率、超聲時間和脈沖時間對多肽殺菌率的影響。利用響應(yīng)面分析法確定了超聲波殺菌的最佳工藝參數(shù)為：超聲功率850 W、超聲時間4.6 min、脈沖時間7 s，此時梅花鹿胎盤多肽的損失率為20.2%，多肽的殺菌率為87.5%，其中細菌總數(shù)為68 CFU/mL，大腸桿菌最大可能數(shù)為零，均符合國家標準。在最佳殺菌工藝條件下獲得的梅花鹿胎盤多肽，對超氧陰離子自由基的清除率比未經(jīng)殺菌處理的多肽僅降低了3.3%，對羥自由基的清除率降低了1.1%，對DPPH自由基的清除率降低了1.7%。這說明超聲波殺菌后的梅花鹿胎盤多肽既達到了商業(yè)無菌的標準，又有效地保持了其生物活性。

梅花鹿胎盤多肽；超聲波殺菌；殺菌率

梅花鹿胎盤具有免疫、抗氧化、延緩衰老、補氣養(yǎng)血、溫經(jīng)散寒等功效[1-2]。將梅花鹿胎盤蛋白水解可制成具有生物活性的多肽，在生物醫(yī)藥、優(yōu)質(zhì)保健食品、活性肽類功能食品的研發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。為實現(xiàn)其商品化銷售，保證活性多肽的食用安全性及產(chǎn)品貯藏性，需對其進行殺菌處理。傳統(tǒng)的熱殺菌中，低溫加熱不能保證殺滅多肽中的全部微生物，高溫加熱又會破壞多肽的生物活性，因此超聲波作為一種“冷殺菌”技術(shù)而日益受到關(guān)注。超聲波能夠在極短的時間內(nèi)產(chǎn)生微射流和局部高熱高壓來殺滅微生物，延長多肽保鮮期的同時，又保證了多肽的生物活性，已經(jīng)成為相關(guān)領(lǐng)域研究應(yīng)用的熱點[5-7]。

本實驗以梅花鹿胎盤多肽為原料，進行超聲波殺菌處理，利用響應(yīng)面分析法，確定超聲波殺菌的最佳工藝條件。同時根據(jù)鹿胎盤多肽具有清除超氧陰離子自由基（O2－·）、羥自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate，DPPH）自由基這一特性，比較殺菌前后多肽清除自由基的能力和多肽損失率，進而為超聲波技術(shù)應(yīng)用于梅花鹿胎盤多肽的殺菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅花鹿胎盤 吉林伊通滿族自治縣吉云鹿業(yè)發(fā)展有限公司。

鄰菲羅啉、焦性沒食子酸等（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DPPH 上?？笊锛夹g(shù)有限公司；胰蛋白酶（酶活力≥250 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活力≥400 U/mg） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；BCA蛋白定量試劑盒 上海博谷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；S-25型pH精密酸度計 上海理達儀器廠；TMTD-8222電熱恒溫水浴鍋 上海精宏試驗設(shè)備有限公司；CT14RD冷凍離心機 上海天美科學(xué)儀器有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；FD5-3美國SIM凍干機 上海龍捷儀器設(shè)備有限公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

新鮮梅花鹿胎盤→洗凈→去除筋膜、血管→剪碎→高速組織勻漿（加入胎盤質(zhì)量2倍的生理鹽水）→雙酶水解→終止反應(yīng)→調(diào)pH值至7.0→離心→收集上清液→冷凍干燥得固體多肽粉末→超聲波殺菌→成品[8]

在此過程中，由于超聲波探頭具有聚能作用，處理液的溫度容易升高，因此在超聲波殺菌過程中將處理液置于冰浴燒杯中，使其溫度保持在0 ℃左右，從而避免多肽變性[9]。

1.3.2 雙酶水解

稱取梅花鹿胎盤勻漿，加熱至52 ℃，恒溫，用l mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至7.0，加入一定量的木瓜蛋白酶與胰蛋白酶（酶活性比1∶1），底物體積分數(shù)10%，開始水解，并不斷地攪拌。同時維持溶液的pH值恒定。反應(yīng)3 h后將水解液升溫到90 ℃，保持10 min滅酶活，冷卻至室溫后，調(diào)溶液pH值至7.0，8 000 r/min離心15 min，取上清液即得梅花鹿胎盤多肽溶液[10]。

1.3.3 單因素試驗

稱取冷凍干燥后的梅花鹿胎盤多肽粉末10 mg置于50 mL小燒杯中，加入30 mL無菌水溶解，充分攪勻，使多肽液質(zhì)量濃度大于200 ?g/mL[8]。進行超聲波殺菌時，確保超聲波探頭完全浸沒于被處理的多肽溶液中；殺菌完成后，迅速用無菌保鮮膜將小燒杯封口，置于無菌操作臺上用于微生物檢測。

固定條件：超聲功率800 W、超聲時間4.0 min、超聲脈沖時間6 s，分別進行超聲功率600、700、800、900、1 000 W；超聲時間3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 min；超聲脈沖時間4、5、6、7、8 s的單因素試驗，以殺菌率、多肽損失率、對O2－·、·OH、DPPH自由基的清除率作為評定指標，應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，分別考察了超聲功率、超聲時間和超聲脈沖時間3個因素對梅花鹿胎盤多肽殺菌工藝的影響[11-12]。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗確定各因素的取值水平范圍，結(jié)合Box-Behnken試驗設(shè)計原理，分別選取超聲功率（X1）、超聲時間（X2）、脈沖時間（X3）作為自變量，以胎盤多肽的殺菌率作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗[13]。

1.3.5 指標測定

1.3.5.1 微生物測定

依據(jù)國家標準GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗：菌落總數(shù)測定方法標準》進行測定，檢測項目為細菌總數(shù)和大腸桿菌總數(shù)。

1.3.5.2 抗氧化活性測定

O2－·清除作用：鄰苯三酚氧化法測定[14]；·OH清除作用：鄰二氮菲法測定[15]；DPPH自由基清除能力：DPPH法測定[16]。

1.3.5.3 多肽含量的測定

采用BCA蛋白濃度測定試劑盒來測定組分中多肽的含量，該法的線性范圍為50～2 000 ?g/mL。

1.3.6 殺菌率和多肽損失率的計算公式

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率對梅花鹿胎盤多肽殺菌效果的影響

圖1 超聲功率對梅花鹿胎盤多肽殺菌率?DDPPPPHH自由基清除率及多肽損失率的影響Fig.1 Influence of ultrasonic intensity on sterilization efficiency and free radical scavenging activity of sika deer placenta polypeptides

由圖1可知，隨著超聲功率增加，對梅花鹿胎盤多肽的殺菌率呈現(xiàn)上升趨勢，在超聲功率為600 W時，殺菌率只有62%；在900 W時，超聲處理對多肽的殺菌率可以達到89%。這是由于超聲功率越大，產(chǎn)生的空化作用越強烈，對微生物的致死作用越強。在超聲功率達到1 000 W時，超聲功率的增加對殺菌率變化影響減小，甚至趨于下降。方差分析表明，不同的超聲波功率對多肽的殺菌率存在明顯差異。并且殺菌率并不是隨功率的增加一直增加下去，而是存在一個最佳值。此現(xiàn)象可以從超聲空化的角度解釋，聲強是影響超聲空化的重要參量。當(dāng)聲強超過空化域值后，提高聲強會使超聲空化增強，但提高聲強有一定的界限，超過了這個界限，空化泡在超聲波的膨脹相內(nèi)可能增長過大，以致它在聲波的壓縮相內(nèi)來不及發(fā)生崩潰，從而造成瞬態(tài)空化減弱效應(yīng)，使殺菌效果反而下降。而且聲強增大，超聲空化增強也會使聲散射衰減增大；聲強增大，非線性引起的附加衰減也隨之增大，這都不利于聲能量的傳播[17-18]。此外加大聲強也會增加能量的損耗，增大成本，產(chǎn)生刺耳噪聲。

同時發(fā)現(xiàn)多肽對O2－·的清除率隨功率的增大而減??；多肽對O2－·和DPPH自由基的清除率在800 W時最大。而且功率在700～900 W時，多肽的損失率相對較??；因此綜合考慮最終殺菌功率選為800 W。

2.1.2 超聲時間對梅花鹿胎盤多肽殺菌效果的影響

圖2 超聲時間對梅花鹿胎盤多肽殺菌率、和DPPH自由基清除率及多肽損失率的影響Fig.2 Influence of ultrasonic treatment time on sterilization efficiency and free radical scavenging activity of sika deer placenta polypeptides

由圖2所示，隨著超聲波作用時間的延長，對梅花鹿胎盤多肽的殺菌率也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。當(dāng)超聲處理3 min時，超聲處理對多肽的殺菌率只有65%，而超聲處理5 min后，梅花鹿胎盤多肽的殺菌率為89%。當(dāng)時間超過4 min后，雖然殺菌率繼續(xù)增加，但是趨勢變緩。且由方差分析表明，4.5～5 min之間，殺菌率無顯著性差異。多肽的損失率隨超聲時間的延長而減小。當(dāng)超聲時間在4.5～5 min之間時，多肽對O2－·的清除率無顯著差異且較高，對DPPH自由基的清除率也較高。但考慮到隨著超聲作用時間延長，多肽的溫度會升高，對多肽的生物活性會產(chǎn)生影響，因此將超聲時間定為4.5 min。

2.1.3 超聲脈沖時間對梅花鹿胎盤多肽殺菌效果的影響如圖3所示，隨著脈沖時間的延長，對梅花鹿胎盤多肽的殺菌率也有所增加。脈沖時間和間隔時間的良好循環(huán)，能夠調(diào)節(jié)空化作用，充分作用于多肽中的微生物[19]。在脈沖時間為6 s時，脈沖時間的延長對殺菌率變化影響減小，殺菌率趨于平緩，且根據(jù)方差分析，在7～8 s之間殺菌率無顯著性差異。多肽對O2－·的清除率在5 s時最大，脈沖時間對·OH的清除率在4、5 s和7 s時均無顯著性差異。雖然脈沖時間在6～7 s之間多肽對DPPH自由基清除率無顯著性差異，但多肽損失率在5 s和7 s時最小，因此綜合考慮將超聲波脈沖時間定為7 s。

圖3 超聲波脈沖時間對梅花鹿胎盤多肽殺菌率、和DPPH自由基清除率及多肽損失率的影響Fig.3 Influence of ultrasonic impulse time on sterilizing efficiency and free radical scavenging activity of sika deer placenta polypeptides

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設(shè)計Table1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計和試驗結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface optimization

以梅花鹿胎盤多肽的殺菌率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取超聲功率、超聲時間、脈沖時間進行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。Box-Behnken試驗設(shè)計的水平及編碼見表1，響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果見表2。

超聲波作用于梅花鹿胎盤多肽，不僅會對微生物有殺滅作用，同時對多肽的抗氧化活性也有會產(chǎn)生影響。梅花鹿胎盤多肽對O2－·、·OH、DPPH自由基的清除能力越大，其抗氧化活性也就越大[20-21]。應(yīng)用Minitab軟件對表2中所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，結(jié)果如表3所示。

表3 多肽殺菌率的回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis for polypeptide sterilization efficiency

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.01）；失擬項不顯著，和分別為0.988 2和0.967 0，說明該模型與實際擬合程度良好；自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可以用于梅花鹿胎盤多肽超聲波殺菌工藝實驗的預(yù)測。各因素經(jīng)過回歸擬合后，得到殺菌率對功率、超聲時間、脈沖時間的二次多項回歸方程為：Y＝87.00＋1.00X＋0.875X＋1.875X－5.875X2－2.125X2－4.125X2＋1.50X1X2＋3.00X1X3＋0.25X2X3。

方差分析結(jié)果還表明，方程的一次項中X1、X2對響應(yīng)值的影響顯著，X3對響應(yīng)值的影響極顯著；二次項對響應(yīng)值的影響極顯著；交互項X1X2、X2X3項對響應(yīng)值的影響顯著，X1X3項對響應(yīng)值的影響極顯著。由此可知，各具體試驗因素對響應(yīng)值的影響并非是簡單的線性關(guān)系。

各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，F(xiàn)值越大，表明對試驗指標的影響越大，即重要性越大[19-20]。結(jié)合方差分析表，對梅花鹿胎盤多肽殺菌率影響程度的大小順序為：脈沖時間＞超聲功率＞超聲時間。根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖（圖4、5），列出的圖為對殺菌率影響顯著的圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析各因素對殺菌率的影響。比較圖4和圖5可知，超聲功率與脈沖時間對殺菌率的影響表現(xiàn)為極顯著，顯示為曲線較陡；而脈沖時間與殺菌時間的影響相比次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，這也與回歸方程各項方差分析的結(jié)果相一致。為了進一步確定最佳點的值，通過對二次多項式數(shù)學(xué)模型的解逆矩陣，得出梅花鹿胎盤多肽最佳殺菌工藝理論值為超聲功率821 W、超聲時間4.6 min、脈沖時間7.31s，預(yù)測殺菌率為87.8%。

圖4 超聲脈沖時間和超聲功率交互作用對多肽殺菌率的響應(yīng)面Fig.4 Response surface curve for Y= f (X1, X3)

圖5 超聲脈沖時間和超聲時間交互作用對多肽殺菌率的響應(yīng)面Fig.5 Response surface curve for Y = f (X2, X3)

2.3 模型驗證

考慮到實際操作性，將最優(yōu)殺菌工藝條件調(diào)整為功率850 W、超聲時間4.6 min、超聲脈沖時間7 s，進行驗證實驗，得到實測殺菌率為87.5%，重復(fù)性好，與預(yù)測值87.8%接近。說明該響應(yīng)面法得到的多肽最佳殺菌工藝條件準確可靠，具有一定的實際指導(dǎo)意義。同時本研究又比較了殺菌前后多肽清除自由基的能力。由表2可知，未經(jīng)殺菌處理的多肽，對O2－·、·OH和DPPH自由基的清除率分別為34.8%、47.3%和65.2%；應(yīng)用實際最佳超聲波殺菌工藝條件（功率850 W、超聲時間4.6 min、脈沖時間7 s）下得到的多肽，對O2－·、·OH和DPPH自由基的清除率分別為31.5%、46.2%和63.5%，與未經(jīng)殺菌處理的多肽相比，清除率分別降低了3.3%、1.1%和1.7%，多肽的損失率為20.2%。同時檢測到細菌總數(shù)為68 CFU/mL，大腸桿菌最大可能數(shù)為零。這說明超聲波殺菌處理后的梅花鹿胎盤多肽，既達到了商業(yè)無菌的標準，又有效地保持了生物活性。

3 結(jié)3 論

本研究以超聲波為殺菌方法，應(yīng)用SPSS和Minitab軟件，確定出梅花鹿胎盤多肽超聲波殺菌的最佳工藝條件：超聲功率850 W、超聲時間4.6 min、脈沖時間7 s，此時實測梅花鹿胎盤多肽的損失率為20.2%，多肽的殺菌率為87.5%，其中細菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)均符合國家標準。與未經(jīng)殺菌處理的多肽相比，最佳超聲波殺菌工藝條件下獲得的多肽對O2－·、·OH和DPPH自由基的清除率分別降低了3.3%、1.1%和1.7%。與傳統(tǒng)的熱殺菌相比較，超聲波殺菌技術(shù)在保證梅花鹿胎盤多肽的生物活性方面有著一定的優(yōu)勢，為確保其食用安全性、促進優(yōu)質(zhì)保健食品的研發(fā)和活性肽類功能食品的市場發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

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Optimization of Ultrasonic Sterilization Process of Sika Deer Placenta Polypeptides by Response Surface Methodology

PI Yu-zhen, GUAN Chu-yu, SUN Wen-hua, YUE Xi-qing
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110086, China)

In this experiment, polypeptides obtained from enzymatic hydrolysis of sika deer placenta were sterilized by ultrasonic radiation. The effects of ultrasonic intensity, treatment time and impulse time on sterilization efficiency were investigated. The optimal parameters were determined by response surface methodology as follows: 850 W of ultrasonic intensity, 4.6 min of ultrasonic treatment time and 7 s of ultrasonic impulse time. The results showed that the polypeptide loss rate was 20.2% and the sterilization efficiency was 87.5% under these conditions. In addition, the total bacterial count was 68 CFU/mL and the most probable number (MPN) of Escherichia coli was zero. All these parameters complied with the national standards. The free radical scavenging activity of sterilized sika deer placenta polypeptides against superoxide anion, hydrolxyl and DPPH radicals was decreased by only 3.3%, 1.1% and 1.7% as compared to the unsterilized counterpart. These results indicate that sterilized sika deer placenta polypeptides reach the requirements of commercial sterilization while maintaining their bioactivity.

sika deer placenta polypeptides; ultrasonic sterilization; sterilization efficiency

TS251.95

A

1002-6630（2014）04-0039-05

10.7506/spkx1002-6630-201404009

2013-06-17

沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目（F12-120-3-00）

皮鈺珍（1974—），女，副教授，博士，研究方向為動物性食品加工。E-mail：1014436061@qq.com