常見肉類鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

高 敬，魏 迪，張癸榮，聶凌云,*

（1.總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100166；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000）

常見肉類鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

高 敬1,2，魏 迪1,2，張癸榮1,2，聶凌云1,2,*

（1.總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100166；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000）

近年來(lái)，食品安全問(wèn)題，尤其是市場(chǎng)上各種肉類摻雜、摻假事件，成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)。嚴(yán)格監(jiān)測(cè)市場(chǎng)上肉制品，必須要有可靠、簡(jiǎn)便、快速的技術(shù)作支撐。本文綜述了現(xiàn)階段常見肉類鑒別技術(shù)的研究進(jìn)展，并著重描述了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain rea ction，PCR)技術(shù)，因其靈敏度高和特異性高、簡(jiǎn)便且耗時(shí)少，逐漸成為肉類檢測(cè)的實(shí)用技術(shù)。

肉類檢測(cè)；傳統(tǒng)方法；免疫學(xué)技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

近幾年曝出了 “老 鼠肉、狐貍?cè)?、水貂肉冒充羊肉”、“清真招牌下的豬肉冒充羊肉”、“羊肉卷添加豬肉鴨肉”和席卷多國(guó)的“馬肉風(fēng)波”以及普遍存在的香腸摻雜摻假等新聞。這些與價(jià)格、原料和宗教有關(guān)的食品安全事件，威脅到人們的日常生活和宗教信仰，日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。食品安全，即對(duì)食品的種類、優(yōu)劣、真?zhèn)蔚蔫b別，尤其是對(duì)肉類的鑒別，均依賴于可靠的檢測(cè)方法。現(xiàn)階段肉類檢測(cè)方法眾多，包括傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代方法，經(jīng)典方法與新興方法。本文綜述了肉類鑒別的主要方法，包括傳統(tǒng)感官鑒別、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法以及其他方法。

1 傳統(tǒng)方法

鑒別肉類的傳統(tǒng)方法主要包括視覺、嗅覺、觸覺、味覺等[1]。視覺鑒別指通過(guò)對(duì)動(dòng)物肉的酮體、肌肉紋理和顏色、脂肪等直接觀察判斷；嗅覺鑒別指對(duì)肉品的氣味判斷鑒別；觸覺鑒別指按壓生肉品，感知肉品的脂肪、肌肉的硬度和彈性來(lái)判別；味覺鑒別是通過(guò)對(duì)肉品經(jīng)加工后的味道來(lái)判別。僅僅的感官判別遠(yuǎn)不能夠鑒別肉類的真假，可作為輔助手段應(yīng)用。

2 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法主要包括試管沉淀法、瓊脂擴(kuò)散法、對(duì)流免疫電泳法、放射免疫法、免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）。其中試管沉淀法應(yīng)用較少，ELISA較為常用。馬永征等[2]詳細(xì)綜述了以ELISA為主的免疫學(xué)技術(shù)在肉類制品檢測(cè)中的研究進(jìn)展。ELISA用于肉類鑒別的原理是利用抗體對(duì)蛋白的識(shí)別來(lái)區(qū)別肉類品種，包括直接法、間接法、間接競(jìng)爭(zhēng)法、ABS-ELISA法、組織印記法、捕獲包被法、A蛋白酶聯(lián)法、斑點(diǎn)免疫吸附法和雙抗體夾心法等[3]。李莉等[4]綜述了ELISA技術(shù)在肉類檢測(cè)中的應(yīng)用，分析了該技術(shù)廣泛的應(yīng)用前景。陸朱發(fā)等[5]利用雙抗夾心ELISA技術(shù)鑒別不同肉類，結(jié)果表明該技術(shù)有較高的敏感性和特異性，并制成商品化診斷盒，以便于有關(guān)部門應(yīng)用。ELISA技術(shù)與傳統(tǒng)鑒別技術(shù)相比，較靈敏可靠，但存在一些弊端，如目標(biāo)分子含量低，各種肉類特異性抗體難以制備且存在交叉反應(yīng)等。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增出特定目的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的DNA片段，以用于鑒別和檢測(cè)。PCR技術(shù)用于肉類鑒別，關(guān)鍵在于能夠找到各類物種特異性的基因片段，并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段?，F(xiàn)常用線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA），原因在于：1）線粒體DNA比核基因小，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定且數(shù)量較多，易于進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2）線粒體DNA比核基因小，自我復(fù)制較快，在一定程度上比核基因進(jìn)化速度快，導(dǎo)致其存在廣泛的種內(nèi)和種間多態(tài)性，適用于相近物種的鑒別；3）線粒體DNA中某些基因區(qū)域具有高度保守性，可通過(guò)設(shè)計(jì)通用引物，擴(kuò)大所鑒別的物種范圍[6]。經(jīng)分析總結(jié)，現(xiàn)階段常用于擴(kuò)增的線粒體DNA區(qū)域包括細(xì)胞色素b（cytochrome b，cyt b）、16S rRNA、12S rRNA、D-loop、ATP6和ATP8等，較少應(yīng)用Myostatin基因[7]。而本實(shí)驗(yàn)室目前以線粒體基因組為模板設(shè)計(jì)引物，并不局限于某個(gè)特定區(qū)域，設(shè)計(jì)方法比較獨(dú)特。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外運(yùn)用PCR技術(shù)以線粒體基因組作為目的基因鑒別肉類的常見應(yīng)用如表1、2所示。常用的PCR技術(shù)有常規(guī)PCR、多重PCR（multiplex PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR（restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCR（random amplified polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）等。

表1 以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)常見肉類鑒別的國(guó)外研究現(xiàn)狀Table1 An overview of species identification of common meats by PCR in foreign countries

表2 以PCR為基礎(chǔ)的常見肉類鑒別的國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀Table2 An overview of domestic species identification of common meats by PCR

3.1 常規(guī)PCR

常規(guī)PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)基本組成成分基礎(chǔ)上發(fā)生聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)，同一體系內(nèi)只有一對(duì)引物和單一目的模板，操作簡(jiǎn)單、快速。侯東軍等[32]以豬的細(xì)胞色素b基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物，建立了一種檢測(cè)牛羊肉中豬肉成分的方法，省時(shí)且特異性高。客觀看來(lái)，常規(guī)PCR方法較傳統(tǒng)方法靈敏，特異性高，較免疫學(xué)方法省時(shí)，但缺乏對(duì)比，需要多組之間相互比較。

3.2 多重PCR（multiplex PCR）

多重PCR指在傳統(tǒng)的常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，于同一體系中加入多對(duì)特異性引物，對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增出多個(gè)目的片段。宗卉等[36]在PCR體系中同時(shí)加入通用引物和牛、羊的特異性引物及牛、羊的mtDNA，建立了多重PCR同時(shí)檢測(cè)牛、羊源性成分的技術(shù)，特異性高，省時(shí)省力。更巧妙的是，Matsunaga等[23]使用多重PCR鑒定了牛、豬、雞、綿羊、山羊和馬6種肉類，即在線粒體細(xì)胞色素b基因上設(shè)計(jì)了一條通用的上游引物和各自特異的下游引物，于同一體系中擴(kuò)增出各自特異的目的片段，并同時(shí)得到各種DNA樣品的檢測(cè)極限。

值得注意的是，多重PCR技術(shù)可同時(shí)加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)DNA片段，前提是每對(duì)引物都能在單一PCR體系中應(yīng)用且結(jié)果理想，當(dāng)同時(shí)將幾對(duì)引物加入一個(gè)體系中，需要重新摸索條件。多重PCR反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)需要考慮到各對(duì)引物及模板的濃度、每對(duì)引物的溶解溫度和引物之間的相互作用以及目的片段的長(zhǎng)度等。建立理想的多重PCR體系可以達(dá)到省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、節(jié)約的效果。

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線、Ct值等對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。RT-PCR技術(shù)中TaqMan RT-PCR技術(shù)和SYBR GreenⅠ RT-PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。前者的原理是根據(jù)在PCR擴(kuò)增時(shí)，熒光標(biāo)記探針被降解，發(fā)出熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成的完全同步，通過(guò)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)來(lái)定量；后者的原理是于SYBR熒光染料特異性地插入到DNA雙鏈之后發(fā)射熒光信號(hào)，使得熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物同步增加，同樣通過(guò)熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)來(lái)定量。本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)以馬肉線粒體DNA為模板，設(shè)計(jì)出馬的特異性引物，利用RTPCR技術(shù)鑒別馬肉及定量肉制品中馬肉含量。

TaqMan RT-PCR技術(shù)可用于單一成分的檢測(cè)，李林等[37]應(yīng)用TaqMan Real-time PCR和常規(guī)PCR技術(shù)快速鑒定肉骨粉中的牛源性成分，分析得出Real-time PCR靈敏度可達(dá)0.0001%，可作為實(shí)驗(yàn)室肉骨粉鑒別的常規(guī)方法；該方法也可用于多成分的檢測(cè)，曾少靈等[38]應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，根據(jù)牛、山羊和綿羊線粒體細(xì)胞色素b基因的差異，設(shè)計(jì)出特異性的引物和Taqman探針，建立了能夠同時(shí)鑒別三者的PCR技術(shù)，并與國(guó)標(biāo)方法比對(duì)分析，該實(shí)驗(yàn)方法無(wú)需電泳、酶切和測(cè)序，使得檢測(cè)效率提高近3倍，靈敏度比國(guó)標(biāo)方法高10倍，適用于檢測(cè)肉類、奶品、生皮、飼料和動(dòng)物油脂等動(dòng)物產(chǎn)品的牛羊源性成分；該方法還可以用來(lái)確定檢測(cè)限及定量限。Dooley等[9]同樣在細(xì)胞色素b基因上設(shè)計(jì)出特異性引物和熒光探針，建立了適用TaqMan RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的方法，且檢測(cè)限低于0.1%。Tanabe等[39]在 細(xì)胞色素b基因上設(shè)計(jì)出特異性引物和熒光探針，建立了鑒別食物中微量的豬肉、雞肉、牛肉、羊肉和馬肉的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法使定量極限達(dá)到100fg/uL，對(duì)加工食品中微量肉源檢測(cè)有很大的幫助。

SYBR Green I RT-PCR技術(shù)同樣可用于定量，楊麗霞等[25]設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，使用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，建立了RT-PCR檢測(cè)牛肉中鴨源性成分的檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1pg。該方法比較靈敏，然而其存在SYBR GreenⅠ熒光染料對(duì)DNA雙鏈模板無(wú)選擇性等特點(diǎn)，特異性較TaqMan RT-PCR差，但成本較TaqMan RT-PCR成本低。

總體來(lái)說(shuō)，熒光定量PCR技術(shù)可以在定性的基礎(chǔ)上，達(dá)到定量檢測(cè)的要求。與其他PCR方法相比，在PCR技術(shù)的高特異性、高靈敏度的基礎(chǔ)上，同時(shí)做出定量檢測(cè)，簡(jiǎn)便可靠，可作為鑒別肉類的實(shí)用技術(shù)。

3.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR（restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR技術(shù)，即PCR-RFLP，是PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。該方法通過(guò)設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，擴(kuò)增一段含有特定限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的DNA片段，經(jīng)酶切和瓊脂糖凝膠電泳，得到特異性的條帶，以鑒別不同基因型。Fajardo等[40]詳細(xì)綜述了以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的肉源性鑒別，供PCR-RFLP技術(shù)在肉類鑒別中的研究與應(yīng)用借鑒。

PCR-RFLP技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于肉類真實(shí)性的檢測(cè)，如馮海永等[41]在線粒體DNA細(xì)胞色素b基因上設(shè)計(jì)出羊（綿羊、山羊）和鴨的通用引物，擴(kuò)增出472bp的片段，分別使用限制性內(nèi)切酶SpeI和Bsu36I對(duì)羊和鴨的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，分別得到羊（綿羊、山羊）和鴨的特異性片段為213bp和259bp、95bp和377bp，可作為一種對(duì)羊肉和鴨肉快速鑒別的簡(jiǎn)便可行的方法。該方法也已用于多樣品的檢測(cè)，如高林[42]提取出豬、牛、羊、雞、鴨、兔、魚的生肉DNA和市售的肉源性食品中肉類的DNA，使用線粒體通用引物（Cytb1/Cytb2）進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)特異性陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行了限制性內(nèi)切酶Mbo I、Alu I、Sau3A I酶切鑒定，結(jié)果表明此種PCR-RFLP方法可準(zhǔn)確鑒別制品中相關(guān)肉源性成分。

PCR-RFLP方法較經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)單易行，尤其適合多樣品的定性研究，較單純的RFLP方法省時(shí)、省力。

3.5 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCR

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性PCR，即RAPD-PCR，是RAPD技術(shù)與PCR技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。該技術(shù)以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)一系列（通常數(shù)百個(gè)）互不相同的隨機(jī)排列堿基順序的寡核苷酸單鏈（通常為10聚體）為引物，對(duì)目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離，經(jīng)EB染色或放射自顯影來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，以觀察DNA片段的多態(tài)性[43]。

PCR-RFLP方法在肉類鑒別中的經(jīng)典應(yīng)用是在1998年Martinez等[44]利用RAPD-PCR技術(shù)成功的鑒別了牛、馬（6個(gè)品種）、騾、驢、水牛、麋鹿、馴鹿、豬肉、羊羔、山羊、袋鼠、鴕鳥以及其他肉類，并且實(shí)驗(yàn)得到清晰的DNA指紋圖譜，很容易的辨別出以上樣品。該實(shí)驗(yàn)表明RAPD-PCR技術(shù)不失為是一項(xiàng)簡(jiǎn)單、可靠和快速的以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)。Saez[45]和Calvo[22]等也分別利用物種特異性的DNA指紋圖譜，用此方法鑒定肉制品真實(shí)性。

RAPD-PC R技術(shù)可以分析已知和未知物種的DNA多態(tài)性，且對(duì)DNA的純度要求不高，但是也存在一些不足，因其所用的引物比一般PCR反應(yīng)短，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生多態(tài)性DNA電泳圖譜，會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析帶來(lái)困難以及實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差；圖譜中的弱帶重復(fù)性差，在未標(biāo)準(zhǔn)化引物數(shù)目、引物長(zhǎng)度和反應(yīng)條件時(shí)，結(jié)果不具有可比性；假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)率相對(duì)較高。

4 其他分析方法

其他肉類鑒別有關(guān)方法包括：1）超聲波技術(shù)，即根據(jù)一些參數(shù)的變化檢測(cè)肉類的物理性質(zhì)，如肌肉和脂肪厚度，可用于檢測(cè)肉類組成成分[46]；2）近紅外光譜（nearinfrared，NIR）技術(shù)分析，可用于鑒別肉品種類、產(chǎn)地和真?zhèn)蝃47]，此方法簡(jiǎn)便快速且信息量大、無(wú)破壞性，但也存在成本高、頻繁維護(hù)和改進(jìn)模型等不理想的方面[48]。這兩種技術(shù)均無(wú)需對(duì)肉品進(jìn)行破壞，且樣品能夠反復(fù)利用，可稱為無(wú)損檢測(cè)技術(shù)。

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Recent Progress on Commonly Used Techniques for Identification of Meat Species

GAO Jing1,2, WEI Di1,2, ZHANG Gui-rong1,2, NIE Ling-yun1,2,*
(1.Insititute for Drug and Instrument Control, Heath Department, The General Logistics Department of People’s Liberation Army, Beijing 100166, China; 2. Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

In recent years, food safety issues have increasingly become the focus of people’s concern, especially the occurrence of adulterated meat products. Reliable technical supports are necessarily provided in a si mple and rapid manner for strict surveillance of meat products in the market. This paper provides an overview of the current advances in commonly used techniques for identification of meat products, with emphasis on reviewing polymerase chain reaction (PCR), which has developed into a practical approach due to its high sensitivity and specificity, simplicity and time saving.

meat species identification; traditional methods; immunological technique; polymerase chain reaction (PCR) technique

TS207.3

A

1002-6630（2014）11-0356-05

10.7506/spkx1002-6630-201411068

2013-09-10

高敬（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称匪幤窓z驗(yàn)。E-mail：gaojing19890616@126.com

*通信作者：聶凌云（1968—），女，副主任藥師，博士，研究方向?yàn)槭称匪幤窓z驗(yàn)。E-mail： nielingyun@126.com