QuEChERS在食品中真菌毒素檢測的研究進展

陳建彪， 董麗娜，劉 嬌，路 磊，趙明明，丁 華，王小紅,4，胡定金，周有祥,*

（1.通標標準技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司，上海 200233；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；4.環(huán)境 食品學教 育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

QuEChERS在食品中真菌毒素檢測的研究進展

陳建彪1， 董麗娜1，劉 嬌2，路 磊3，趙明明3，丁 華3，王小紅2,4，胡定金3，周有祥3,*

（1.通標標準技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司，上海 200233；2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；4.環(huán)境 食品學教 育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

真菌毒素是重要的食品安全危害因子，建立高通量真菌毒素分析方法將有效降低人群的真菌毒素暴露風險，而實現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中多種真菌毒素的聯(lián)合提取是建立這類分析技術(shù)的前提保證。QuEChERS是集快速（quick）、簡單（easy）、便宜（cheap）、有效（effective）、可靠（rugged）、安全（safe）于一體前處理技術(shù)的簡稱，本文通過介紹QuEChERS技術(shù)的原理和近年來該技術(shù)在真菌毒素分析領(lǐng)域的應(yīng)用，針對真菌毒素的理化性質(zhì)和樣品基質(zhì)特點，探討了QuEChERS技術(shù)中不同提取液和凈化劑的優(yōu)缺點和適用范圍，分析該技術(shù)在提取凈化過程中存在的問題，提出了改進思路，并展望今后QuEChERS技術(shù)在多真菌毒素聯(lián)合分析的發(fā)展趨勢。

QuEChERS；真菌毒素；食品；農(nóng)產(chǎn)品

真菌毒素主要是一類由產(chǎn)毒絲狀真菌（通常稱作產(chǎn)毒真菌）產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。目前，已發(fā)現(xiàn)了300～400種真菌毒素，主要來源于鐮刀菌屬（Fusarium），曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）的200多種產(chǎn)毒絲狀真菌[1-2]。在適宜條件下，產(chǎn)毒絲狀真菌極易在產(chǎn)前和產(chǎn)后侵染農(nóng)作物，造成真菌毒素殘留，威脅人畜健康。為了最大限度減小人群的真菌毒素暴露風險，世界各國均建立了一系列真菌毒素限量和檢測標準，加強食品和飼料中真菌毒素殘留的監(jiān)控力度。

早期真菌毒素的分析方法主要是針對是單一毒素檢測，如：薄層層析（thin layer chromatography，TLC）[3]，但這類方法通常是半定量方法，不具備高通量分析能力，難以滿足當前食品 分析的要求。而以酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）為代表的免疫分析方法，其檢測效率高，但這類方法存在干擾因素多，重現(xiàn)性較差等問題[4-5]，因此多用于樣品快速檢測或初篩。隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展及推廣，真菌毒素高通量分析的儀器檢測方法在真菌毒素分析中的應(yīng)用報道也越來越多，以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[7]、毛細管電泳色譜法（capillary electrophoresis，CE）[8]和超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）[9]等為代表的現(xiàn)代儀器方法，由于重現(xiàn)性好，檢出限低，常作為真菌毒素的定量或仲裁方法。綜合上述真菌毒素儀器分析方法的特點，我們發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代儀器分析技術(shù)正朝著廣譜分析、自動分析、痕量分析、快速分析以及綠色分析的趨 勢發(fā)展[10-11]。

由于儀器分析方法靈敏度高，痕量干擾物質(zhì)會嚴重影響最終分析結(jié)果。因此有效的提取凈化方法是實現(xiàn)現(xiàn)代分析的前提保證。目前應(yīng)用于真菌毒素分析的提取凈化方法包括：固相萃取（solid-phase extraction）[12]、固相微萃取（solid-phase microextraction）[13]、超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction）[14]、免疫親和萃?。╥mmunoaffinity extraction）[15]、快速溶劑萃?。╝ccelerated solvent extraction）[16]和基質(zhì)固相分散萃?。╩atrix solid-phase dispersion）[17]等，但上述方法多用于單一或者同類毒素的提取凈化，在多真菌毒素毒素分析方面報道較少。近年來，QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）技術(shù)作為一項新興的高效提取凈化技術(shù)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析檢測中，其高效、簡便和綠色的技術(shù)理念正逐漸在獸藥殘留[18]、食品添加劑[19]、生物毒素[20]以及環(huán)境污染 物[21-22]等分析檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用。本文根據(jù)QuEChERS技術(shù)的特點，結(jié)合樣品基質(zhì)特征和真菌毒素的理化性質(zhì)，對QuEChERS技術(shù)在真菌毒 素分析中的應(yīng)用做簡要綜述。

1 QuEChERS技術(shù)簡介

QuEChERS技術(shù)是由Anastassiades等[23]研究人員在基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上，整合了提取、固相萃取等步驟，建立的集快速（quick）、簡單（easy）、便宜（cheap）、有效（effective）、可靠（rugged）、安全（safe）為一體的樣品提取凈化技術(shù)，即QuEChERS技術(shù)。一般而言，QuEChERS技術(shù)分為提取、鹽析和凈化3個步驟（圖1）。即先以有機溶劑（如：乙腈、丙酮和乙酸乙酯等）與水按照一定比例混合后萃取待測物，再經(jīng)過鹽析劑（如：無水MgSO4、Na2SO4和NaCl等）鹽析分層，最后取目標提取液至裝有凈化劑（如：乙二胺-N-丙基硅烷、佛羅里硅土、石墨化炭黑和C18鍵合硅膠等）的聚四氟乙烯離心管中凈化，經(jīng)振搖離心后，取上清液進行儀器分析[10]。

圖1 常見QuEChERS法的操作步驟Fig.1 Schematic procedure of the most commonly used QuEChERS

QuEChERS技術(shù)最初是作為高含水量樣品（＞75%，如水果和蔬菜等）中多農(nóng)藥殘留的提取凈化方法[23]。隨后在低含水量（＜25%，如谷物）和油脂類樣品（如：肉、蛋和植物油等）的多農(nóng)藥殘留分析中也得到了應(yīng)用[24-25]。隨著人們對QuEChERS技術(shù)中提取液、鹽析劑以及凈化劑等相關(guān)內(nèi)容研究的深入，適用于其他食品安全危害因子（如：食品添加劑、獸藥、真菌毒素以及多環(huán)芳烴等）的相關(guān)方法也不斷被開發(fā)和報道[18-19,22]。

2 QuEChERS方法在農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素檢測的應(yīng)用

大多數(shù)農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)成分豐富，在適宜條件下，極易受到產(chǎn)毒真菌的侵染，這使得相關(guān)消費群體（人和畜禽等）具有較高的真菌毒素暴露風險。特別需要指出的是，傳統(tǒng)的真菌毒素提取凈化方法，通常需要經(jīng)過多次溶劑提取凈化，不僅存在較高的真菌毒素暴露風險，還需要使用大量的高毒試劑，這使得大多數(shù)操作人員對于分析真菌毒素具有較強的戒備心理。較之傳統(tǒng)的真菌毒素提取凈化方法，QuEChERS技術(shù)的整個分析體系具有以下顯著優(yōu)勢：1）實驗設(shè)備簡單。整個QuEChERS處理僅需要離心管、振蕩器、離心機即可完成。2）試劑使用量少。在全部提取凈化步驟中，有機試劑使用量大約在5～25mL之間，廢棄液在15mL以內(nèi)，對環(huán)境污染小。3）前處理步驟少。整個提取凈化操作是在重復(fù)振蕩—離心—再振蕩中完成，操作技術(shù)難度低，適宜推廣。4）處理時間短。全部提取凈化步驟可在30min內(nèi)完成，適合批量分析。5）實現(xiàn)多組分提取凈化。通過設(shè)計提取液配方，選擇適宜鹽析劑和凈化劑，可實現(xiàn)多真菌毒素的聯(lián)合提取，提高分析效率。6）操作人員暴露風險低。QuEChERS技術(shù)的操作過程簡單，處理時間短，溶劑使用量少，可控性強。

基于上述優(yōu)點，根據(jù)真菌毒素和樣品基質(zhì)的理化特性，開發(fā)真菌毒素，尤其是多真菌毒素的QuEChERS技術(shù)正逐漸成為真菌毒素研究領(lǐng)域的熱點。

目前，QuEChERS技術(shù)已應(yīng)用于真菌毒素分析，現(xiàn)已報道的毒素主要包括：15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-acetyldeoxynivalenol，15-AcDON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）、T-2毒素（T-2 toxin，T-2）、HT-2毒素（HT-2 toxin）、黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2（aflatoxin B1、B2、G1、G2，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、赭曲霉毒素A （ochratoxin A，OTA）、橘霉素（citrinin，CIT）、伏馬菌素（fumonisin，F(xiàn)UN）、麥角克堿（ergocristine，ERG）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、棒曲霉毒素（patulin，PAT）以及環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid，CPA）等，具體見表1。

2.1 樣品基質(zhì)和目標毒素

目前QuEChERS技術(shù)在真菌毒素檢測分析中的應(yīng)用，主要是針對極易在生長、貯藏過程中發(fā)生真菌污染的高淀粉、高蛋白的樣品，如：玉米、小麥及其制品等。由于這些樣品基質(zhì)中的淀粉和蛋白質(zhì)等組分在提取和凈化過程中極易發(fā)生交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使毒素難以從樣品中游離出來[11]，因此通常在分析這類樣品前，添加一定量的去離子水，充分浸潤樣品，以提高有機溶劑對非水溶性基質(zhì)的滲透性和提取效率[40]。

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌的次生代謝產(chǎn)物，其種類多，結(jié)構(gòu)差異較大，即使是同類毒素，也有較多的衍生物。如何建立有效的QuEChERS分析技術(shù)是目前急需解決的問題之一?，F(xiàn)有報道表明，不管是提取同類別還是不同類別的真菌毒素，只要極性相似，QuEChERS技術(shù)都有較高的提取效率，例如：DON、T-2等A、B類單端孢霉烯族毒素，來源于同一種屬的產(chǎn)毒真菌，且都屬于極性毒素，針對其結(jié)構(gòu)相近，極性相似的特點，Sospedra等[26]以QuEChERS技術(shù)提取凈化了面粉中的單端孢霉烯族毒素，而FUN也屬于極性毒素，Zachariasova等[30]根據(jù)其極性與單端孢霉烯族毒素極性相近，采用QuEChERS技術(shù)實現(xiàn)了單端孢霉烯族毒素和伏馬菌素的聯(lián)合分析。

2.2 提取液

從本質(zhì)上說，QuEChERS技術(shù)是在液液分配（有機試劑與水）的基礎(chǔ)上采用了基質(zhì)固相分散技術(shù)實現(xiàn)了樣品的高效提取和凈化。作為QuEChERS技術(shù)重要的組成部分，提取液的提取效率決定著最終分析結(jié)果的準確性。在傳統(tǒng)真菌毒素的檢測方法中，乙腈、丙酮、乙酸乙酯與三氯甲烷等通常具有較好的提取效率，但綜合各種試劑的理化性質(zhì)和在QuEChERS中的提取效果，乙腈以其提取率高，適用范圍廣的特點，應(yīng)用最多。這是因為乙腈為極性較強的低毒溶劑（極性5.8），具有優(yōu)良的溶解性，根據(jù)“相似相溶”的原理，對大多數(shù)非極性和部分極性真菌毒素有較高的提取率，特別是在鹽析作用下，極易從水相中萃取極性較弱的毒素。丙酮極性（極性5.1）與乙腈相似，對AFB1和OTA提取效果較好，但該溶劑的鹽析效果較差，而且難以去除水溶性雜質(zhì)干擾，一般不作為QuEChERS技術(shù)中的主要提取試劑。乙酸乙酯（極性4.4）極性低于乙腈和丙酮，水溶性差，提取單一強極性毒素（如：OTA和CIT）效果較好，可作為聯(lián)合提取多種真菌毒素的輔助試劑使用[10,26-27]。

表1 QuEChERS方法在真菌毒素檢測中的應(yīng)用Table1 Application of QuEChERS in the analysis of mycotoxins

雖然單一乙腈作為提取液對多真菌毒素的聯(lián)合提取效果較好，但對pH值、極性范圍敏感的真菌毒素提取時，需在提取液中添加輔助試劑（乙酸、甲酸和甲醇等）以增強聯(lián)合提取的效果[26,28-29,34-39]。例如：在分析橘霉素時，由于CIT屬于兩性化合物，使用單一乙腈的效果并不理想，但調(diào)節(jié)提取液pH值至CIT的等電點后，可有效降低CIT的水溶性，回收率可從30%增至70%以上；相似的，F(xiàn)UN也屬于酸性毒素，在提取液中添加一定量的酸后，在玉米樣品中的回收率可達80%[29]。

2.3 鹽析劑

樣品經(jīng)過提取后，提取液中仍然存在大量的共萃物，通過鹽析步驟，可以初步去除部分水溶性雜質(zhì)。當提取液中添加了鹽析劑后，提取液中的有機相分子（如：乙腈）會由于離子強度的增加，斷開與水分子間的氫鍵，從水中鹽析出來。在QuEChERS技術(shù)中，常用鹽析劑包括：MgSO4、MgCl、NaNO3、NaSO4、NaCl和LiCl等。其中MgSO4和NaCl的鹽析效果最好[23]。MgSO4有強結(jié)合水的能力（20℃的水溶解度為337g/L），不但顯著減少混合提取液中的水含量，而且能飽和水溶液促使混合液分層。但添加過量MgSO4易形成結(jié)塊使提取液與樣品顆粒接觸不充分，而且會釋放過多的熱量引起過高的溫度，影響檢測結(jié)果的準確度。NaCl可以與MgSO4協(xié)同飽和水溶液，加速提取液分層。通過控制NaCl的添加量可以調(diào)節(jié)乙腈層中水含量，進而控制提取液中分析物和雜質(zhì)在兩相中的分配。合理的MgSO4和NaCl使用量，不但有效促使提取液分層，而且可以控制共萃取物與分析物的分離。因此分析真菌毒素時，多數(shù)研究人員模擬果蔬中農(nóng)殘分析的QuEChERS技術(shù)，采用4g MgSO4和1g NaCl的混合鹽促使提取液分層并獲得了理想的分層效果[28-33,37]。

2.4 凈化劑

當樣品提取液經(jīng)鹽析分層后，少量的蛋白質(zhì)、油脂、色素以及糖組分會不可避免地與真菌毒素共同萃取出來，嚴重干擾殘留的分析結(jié)果。在經(jīng)典的QuEChERS技術(shù)中，通常選用乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、C8、C18（或ODS）、氰丙基鍵合硅膠（cyanopropyl，—CN）、胺丙基鍵合硅膠（aminopropyl，—NH2）等凈化劑。這些凈化劑可通過極性相互作用，或者非極性相互作用使目標物和雜質(zhì)相互分離。

PSA的結(jié)構(gòu)上有兩個氨基，可與分子結(jié)構(gòu)上含有羥基的極性物質(zhì)發(fā)生氫鍵相互作用，吸附共萃取物中的極性有機酸、極性色素等雜質(zhì)，在凈化非極性類真菌毒素（如：AFT）中的雜質(zhì)效果較好。Trebstein等以PSA為凈化劑分析玉米和小麥中的AFT、DON和T2等多種真菌毒素，有效去除了樣品中的酸性雜質(zhì)和極性色素[33]，但Desmarchelier等[29]認為PSA上的氨基容易與酸性毒素（FUN、CIT和OTA等）上的羧基發(fā)生反應(yīng)，一般不適用于凈化這類毒素。

GCB具有陰離子交換作用的吸附劑，通過疏水相互作用和氫鍵相互作用吸附雜質(zhì)，對具有平面分子結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)（如：甾醇和葉綠素等）吸附作用顯著，而且對具有平面分子結(jié)構(gòu)或不完全平面分子結(jié)構(gòu)的真菌毒素也有較強的吸附作用，在分析飼料中的AFT、ZEN和雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol）時，GCB幾乎可以吸附全部具有平面結(jié)構(gòu)的毒素[41]。

基于含有C18或者C8烷基鏈的凈化劑是目前廣泛使用的反相吸附材料，可通過非極性相互作用吸附非極性物質(zhì)，可以有效去除凈化樣品中的淀粉、糖類和脂肪類物質(zhì)。Cunha等[31]在分析谷物中的ZEN、FUN、NIV、DON和15-AcDON時，發(fā)現(xiàn)C18與MgSO4混合對提取液有顯著的 凈化作用。

另外，含有—CN和—NH2等活性基團的 凈化劑可通過氫鍵作用吸附極性物質(zhì)（脂肪酸和有機酸等），在農(nóng)藥殘留和獸藥殘留分析上有著廣泛應(yīng)用[42]。雖然相關(guān)報道較少，但在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)—NH2吸附材料強烈吸附飼料中的極性色素，凈化非極性毒素（如：AFT）的效果顯著。

樣品在經(jīng)過QuEChERS技術(shù)處理后，最終的樣品液仍會存在一定量的共萃物干擾物，這些干擾物仍然會影響待測物的檢測信號，特別是在使用紫外或者熒光等光學檢測器時，干擾更為嚴重。因此大多報道通常是采用具有高選擇性的質(zhì)譜檢測器，特別是串聯(lián)質(zhì)譜檢測器來進行分析，以提高分析靈敏度和準確度。

綜上所述，QuEChERS技術(shù)在真菌毒素分析領(lǐng)域，特別是多真菌毒素分析檢測中體現(xiàn)出的優(yōu)勢，使得該技術(shù)備受關(guān)注。通過對QuEChERS技術(shù)中的提取液、鹽析劑和凈化劑的系統(tǒng)研究，將是建立適宜不同樣品基質(zhì)的更有效的QuEChERS技術(shù)的有力保證。

3 QuEChERS法應(yīng)用于真菌毒素分析領(lǐng)域的展望

樣品前處理是分析檢測中“去蕪存菁”的關(guān)鍵步驟，直接關(guān)系到分析結(jié)果的準確性和可靠性。真菌毒素作為一個重要的食品安全危害因子，如何科學、準確、客觀評價農(nóng)產(chǎn)品中毒素殘留水平，是當前真菌毒素分析檢測領(lǐng)域中的急需解決的問題。QuEChERS方法以提取凈化效率高、環(huán)境污染小、操作簡單快速以及操作風險低等優(yōu)點，滿足了真菌毒素檢測分析的需求，但現(xiàn)有QuEChERS方法在以下幾點仍存在進一步改進的空間，以滿足真菌毒素，特別是多真菌毒素檢測的發(fā)展趨勢。

3.1 Q uEChERS提取液和鹽析劑的選擇

通過設(shè)計不同提取液配方來提高提取液從樣品基質(zhì)中提取目標物的提取能力；通過設(shè)計不同提取液配方或者提取方法來實現(xiàn)不同極性毒素的聯(lián)合提?。煌ㄟ^選擇不同鹽析劑來降低雜質(zhì)在目標提取液中的分配比例，減少共萃取雜質(zhì)。

3.2 凈化劑材料的選擇

通過設(shè)計、選擇不同凈化劑來實現(xiàn)降低樣品基質(zhì)雜質(zhì)干擾，尤其找到適用于高脂肪、高蛋白和高淀粉的樣品基質(zhì)的凈化劑；研究吸附劑的理化性質(zhì)，通過添加輔助試劑，降低吸附劑對目標毒素的吸附，實現(xiàn)不同極性毒素的聯(lián)合凈化。

3.3 擴展QuEChERS技術(shù)的適用性

改進QuEChERS技術(shù)，使樣品經(jīng)QuEChERS技術(shù)提取凈化后，適合紫外、熒光檢測器的分析方法；利用QuEChERS技術(shù)的先進理念，開發(fā)適用于其他真菌毒素分析技術(shù)，特別是快速分析技術(shù)，如適合ELISA的QuEChERS技術(shù)。

總之，QuEChERS技術(shù)是一個具有先進理念的前處理技術(shù)。建立提取范圍更廣，提取效率更高，操作更簡單，更環(huán)保的QuEChERS技術(shù)將是后續(xù)相關(guān)研究的重點。

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Advances in Application of QuEChERS for Mycotoxin Analysis in Foods

CHEN Jian-biao1, DONG Li-na1, LIU Jiao2, LU Lei3, ZHAO Ming-ming3, DING Hua3, WANG Xiao-hong2,4, HU Ding-jin3, ZHOU You-xiang3,*
(1. SGS-CSTC Standards Technical Services (Shanghai) Co. Ltd., Shanghai 200233, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 3. Institut e of Agricultural Quality Standard s and Testing Technology Research, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China; 4. Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, Wuhan 430070, China)

Mycotoxins are a group of important risk factors of food safety. Simultaneous extraction of mycotoxins from complex sample matrices is a prerequisite to establish a high-throughput analytical method which in turn will provide useful test data for reducing the human health risks posed by mycotoxin exposure. QuEChERS, an acronym for Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe, is a commonly used sample preparation techni que. In this paper, the principle of QuEChERS technique and its applications in mycotoxin analysis are reviewed. The advantages and disadvantages of different extraction solvents and sorbents in QuEChERS are discussed on the basis of the matrix effects and the chemical and physical characteristics of mycotoxins. Finally, some improvements and future trends in the application of QuEChERS technique for mycotoxin analysis are proposed.

QuEChERS; mycotoxins; food; agricultural products

O652.6

A

1002-6630（2014）11-0286-06

10.7506/spkx1002-6630-201411057

2013-05-18

國家自然科學基金面上項目（31271876）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（2013PY103）；湖北省公益性專項基金項目（2013BBB12）；湖北省農(nóng)業(yè)科學院青年科學基金項目（2011NKYJJ22）；湖北省農(nóng)業(yè)科 技創(chuàng)新中心基金項目（2012-620-001-03）

陳建彪（1983—），男，碩士，主要從事食品分析研究。E-mail：chenbiao416@126.com

*通信作者：周有祥（1979—），男，副研究員，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品風險評估研究。E-mail：zhouyouxiang@gmail.com