桑葚多糖調(diào)節(jié)血糖代謝及體外抗氧化效果研究

王 強(qiáng)，王 睿，王 存，龍 潔

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；2.重慶第二師范學(xué)院教務(wù)處，重慶 400067）

桑葚多糖調(diào)節(jié)血糖代謝及體外抗氧化效果研究

王 強(qiáng)1，王 睿1，王 存1，龍 潔2

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；2.重慶第二師范學(xué)院教務(wù)處，重慶 400067）

研究桑葚多糖（mulberry polysaccharides，MBPs）對糖尿病大鼠的降糖效果及體內(nèi)外抗氧化活性。在體外化學(xué)條件下，測定MBPs清除·OH和O2－·能力；采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠分別灌胃150、300、450mg/（kg·d）劑量的MBPs。結(jié)果表明：MBPs清除·OH和O2－·的EC50分別為0.17、0.54mg/mL；MBPs能顯著改善糖尿病大鼠血糖水平、血脂指標(biāo)（甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇）、脂質(zhì)過氧化水平（丙二醛）和血清抗氧化狀態(tài)（谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶及總抗氧化能力）；MBPs具有降血糖作用。

桑葚多糖；糖尿??；血糖代謝；抗氧化

桑葚為?？坡淙~喬木桑樹（Morus alba L.）的成熟果實(shí)，具有較高營養(yǎng)和藥用價(jià)值，被譽(yù)為“民間圣果”；其含有礦物質(zhì)、維生素、多酚和多糖等生物活性成分，是一種優(yōu)質(zhì)的功效成分提取資源[1-4]。國內(nèi)外研究表明，桑葚具有烏發(fā)明目、滋陰補(bǔ)血、潤腸通便、補(bǔ)肝益腎、增強(qiáng)免疫、降血壓、降血脂和抗衰老等功效[5-8]，這使桑葚作為一種特效營養(yǎng)保健食品備受人們的重視?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的研究表明桑葚中的活性多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體血糖水平等功能[9]，已成為當(dāng)前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。趙喜蘭等[10]研究發(fā)現(xiàn)，桑葚多糖中的DEAE-纖維素柱分離中性多糖P-1的降糖效果較高，但未對桑葚多糖的降糖機(jī)理進(jìn)行深入研究。

我國每年利用的桑葉數(shù)千噸，但對桑葚資源的利用十分有限[11-12]。若將這些廢棄的桑葚作為生產(chǎn)活性多糖的原料，將會產(chǎn)生大量的優(yōu)質(zhì)的桑葚多糖（mulberry polysaccharides，MBPs）。本實(shí)驗(yàn)研究了MBPs在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)條件下，MBPs清除·OH和O2－·能力；同時(shí)采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠分別灌胃150、300、450mg/（kg·d）劑量的MBPs，探討其對糖尿病大鼠血糖、血脂的影響，對于桑葚多糖的科學(xué)研究、引導(dǎo)桑葚產(chǎn)業(yè)發(fā)展、指導(dǎo)消費(fèi)及宣傳具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

桑葚：采自于重慶忠縣農(nóng)戶桑葚園，經(jīng)鑒定為?？浦参锷orus alba L.的成熟果穗。

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 美國Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；冷凍離心機(jī) 美國貝克曼公司；LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；血糖儀 北京怡成生物電子技術(shù)有限公司；生化試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 MBPs的制備

選擇新鮮無病蟲害、質(zhì)地油潤、肉質(zhì)致密、色澤鮮艷的成熟桑葚作為原料。將原料清洗，原料干燥（65 ℃，DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱）至水分含量8%；粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩。用80%的乙醇溶液（液料比為15∶1（V/m））85 ℃熱處理兩次（2×1 h），以除去單糖、低聚糖和色素等小分子物質(zhì)，同時(shí)滅酶活以防止在提取過程中多糖的降解。抽濾、濃縮、真空冷凍干燥，得到預(yù)處理原料（得率87.4%）。預(yù)處理后的桑葚干粉于95 ℃熱水提取兩次（2×2 h，液料比為32∶1（V/m））→離心（1 510×g，10 min）→合并上清液→95%乙醇、100%乙醇和丙酮分別處理，4 ℃放置24 h→離心（1 510×g，10 min）→溶解，Sevag方法脫蛋白[13]（Sevag法脫蛋白10 次）→透析→冷凍干燥→MBPs（多糖的得率7.6%）

1.2.2 體外抗氧化活性的測定

1.2.2.1 清除·OH的測定

參照Wang Hongyuan等[14]方法并略有修改。取0.6 mL鄰二氮菲的乙醇溶液（5 mmol/L），加入0.4 mL的磷酸鹽緩沖液（0.15 mol/L，pH 7.40）和0.6 mL的FeSO4（0.75 mmol/L），加入待測MBPs 2 mL混勻后，加入0.4 mL的體積分?jǐn)?shù)0.1%H2O2搖勻，37℃條件下水浴60min，在536 nm波長處測其吸光度（Ai）；以去離子水代替MBPs和H2O2溶液重復(fù)上述操作，在536 nm波長處測其吸光度（Ac）；以去離子水代替MBPs來重復(fù)以上操作，在536 nm波長處測得吸光度（Aj）。按式（1）計(jì)算·OH清除率。

1.2.2.2 清除O2－·的測定參照Zhang Tao等[15]的方法，取MBPs 0.1mL，加入0.1mol/L Tris-HCl（pH8.2）緩沖溶液2.8mL混勻，在25 ℃水浴10min后加入3 mmol/L的鄰苯三酚溶液（25 ℃水浴預(yù)熱）0.1 mL，混勻后迅速在320 nm波長處測定吸光度，每隔30 s讀取A320nm，5 min后結(jié)束；以去離子水0.1 mL和0.1 mol/L的Tris-HC1（pH 8.2）緩沖溶液2.8 mL調(diào)零；空白對照管以去離子水代替MBPs。作吸光度隨時(shí)間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率v，按式（2）計(jì)算O2－·清除率。

1.2.3 桑葚多糖對STZ糖尿病大鼠血糖代謝的調(diào)節(jié)作用

1.2.3.1 糖尿病動物模型的建立

實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)條件為：溫度18～22℃、濕度45%～55%，自然光照，自由采食和飲水。將實(shí)驗(yàn)用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（160～200 g）適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，禁食24 h（不禁水），腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（60 mg/kg，溶于0.10 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.2，現(xiàn)用現(xiàn)配），造模3 d后禁食12 h測空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L即為造模成功。

1.2.3.2 動物分組

正常SD大鼠10 只作正常對照組（NC），將造模成功的糖尿病大鼠50 只按血糖值隨機(jī)（按血糖值≥11.1mmol/L隨機(jī)分配）分為5 組：糖尿病模型組（DM）、胰島素治療組（IC）、多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組（MBPs-L、MBPs-M、MBPs-H）。多糖低、中和高劑量組每天分別一次性灌胃150、300、450 mg/（kg·d）劑量的桑葚多糖水溶液2 mL，正常對照組和糖尿病模型組每天一次性灌胃0.9%生理鹽水，胰島素治療組每天一次性接受20 units/（kg·d）劑量的胰島素，實(shí)驗(yàn)周期21 d，各組給予基礎(chǔ)飼料和自由飲水。

1.2.3.3 測試樣品的制備和檢測

分別于0、7、14、21 d定時(shí)減尾取血，用血糖儀測量各組大鼠空腹血糖；于末次灌胃后禁食12 h，摘眼球取血，收集血液，4 000 r/min離心10 min，上清液備用，所有處理均在4 ℃條件下完成。血清總膽固醇（serum total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定；蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 15數(shù)據(jù)處理軟件，各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，并進(jìn)行方差分析，LSD法多重比較，P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MBPs體外抗氧化活性

STZ是自由基激活劑，可直接導(dǎo)致胰島組織中H2O2和等自由基的增高，從而引起胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失，引起糖代謝紊亂，引發(fā)糖尿病[17]。自由基與機(jī)體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生密切相關(guān)，由圖1、2可知，MBPs對·OH和都有一定的清除作用，且均隨MBPs劑量的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)。一般用EC50（自由基清除率為50%時(shí)的所需樣品的質(zhì)量濃度）對自由基的清除能力進(jìn)行衡量，其值越小，清除能力就越強(qiáng)。MBPs清除·OH和的EC50分別為0.17 mg/mL和0.54 mg/mL。

圖1 MBPs清除OH的能力Fig.1 ·OH scavenging activity of MBPs

圖2 2 MBPs清除Ps的能力Fig.2 scavenging activity of MBPs

2.2 MBPs對糖尿病大鼠血糖的影響

圖3 各組大鼠的血糖水平Fig.3 Blood glucose concentrations of rats

由圖3可知，給藥前與正常對照組（NC）相比，各糖尿病模型組大鼠血糖值均維持在較高水平，具有極顯著性差異（P＜0.01），說明造模成功的大鼠血糖含量較正常組明顯升高。給藥21d后，與糖尿病模型組（DM）比較，胰島素治療組（IC）和不同劑量多糖組具有極顯著性差異（P＜0.01），說明MBPs能抑制或降低大鼠血糖值的升高，其效果與多糖計(jì)量成正相關(guān)，并且效果比IC組明顯。

2.3 MBPs對各組大鼠血脂的影響

圖4 不同劑量的MBPs對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清的TG（A）、TC（B）、LDL-C（C）和HDL-C（DD）影響Fig.4 Effects of different levels of MBPs on TG (A), TC (B), LDL-C (C), and HDL-C (D) levels in STZ-induced diabetic rats

由圖4可知，模型對照組大鼠血清中血脂4項(xiàng)，即TG、TC、LDL-C和HDL-C與正常對照組相比差異顯著（P＜0.05）。MBPs低、中、高劑量組大鼠血清TG、TC和LDLC水平均低于模型對照組，HDL-C水平均高于模型對照組， 差異顯著（P＜0.05）。隨著劑量的增加，STZ糖尿病大鼠血清TG、TC和LDL-C水平呈下降趨勢，而HDL-C水平呈上升趨勢。說明MBPs對STZ糖尿病大鼠的血脂指標(biāo)具明顯的調(diào)節(jié)作用。并且MBPs高劑量組各血脂指標(biāo)與正常對照組相比無顯著差異，表明高劑量組可有效降低STZ糖尿病大鼠血脂。

2.4 MBPs對脂質(zhì)過氧化水平和血清抗氧化狀態(tài)的影響

圖5 不同劑量的MBPs對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清的SOD（A）、MDA（B）、GSH-Px（C）、T-AOC（D）水平的影響Fig.5 Effects of different levels of MBPs on SOD (A), MDA (B), GSH-Px (C), and T-AOC (D) levels in STZ-induced diabetic rats

由圖5A可知，與糖尿病模型組相比，MBPs低、中和高劑量組的血清SOD活性顯著提高（P＜0.05），MBPs高劑量組的血清SOD活性與正常對照組相比沒有顯著差異，MBPs高劑量組對SOD活性增強(qiáng)效果優(yōu)于胰島素治療組。由圖5B可知，MBPs低、中和高劑量組與糖尿病模型組相比，血清MDA含量分別降低了17.4%、27.5%和36.2%，差異顯著（P＜.05），并且MBPs高劑量組對MDA含量的降低效果與正常對照組相比沒有顯著差異。由圖5C可知，與糖尿病模型組相比，MBPs低、中和高劑量組的血清GSH-Px活性顯著提高（P＜0.05），MBPs高劑量組的血清GSH-Px活性與正常對照組相比沒有顯著差異，MBPs高劑量組對GSH-Px活性增強(qiáng)效果優(yōu)于胰島素治療組。由圖5D可知，MBPs低、中、高劑量組大鼠血清T-AOC水平均顯著高于模型對照組（P＜0.05），隨著劑量的增加，STZ糖尿病大鼠血清T-AOC水平呈上升趨勢。結(jié)果說明MBPs對STZ糖尿病大鼠的脂質(zhì)過氧化水平和血清抗氧化狀態(tài)具明顯的調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié) 論

3.1 MBPs對·OH和O2－·有一定的清除活性，且MBPs清除自由基活性與其質(zhì)量濃度呈正比。

3.2 實(shí)驗(yàn)研究了不同劑量的MBPs對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血糖水平、血脂指標(biāo)、脂質(zhì)過氧化水平和血清抗氧化狀態(tài)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MBPs能顯著降低STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血糖水平，增強(qiáng)糖尿病大鼠血清SOD和GSH-Px活性，增加大鼠血清T-AOC含量，降低其血清MDA含量。同時(shí)MBPs治療組與模型組比較，TG、TC、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高。MBPs有較好的防治糖尿病的作用，并且其作用優(yōu)于短效胰島素。MBPs具有降血糖作用，這為MBPs有可能成為新的天然降糖藥物或保健品提供了科學(xué)依據(jù)。

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Effects of Mulberry Polysaccharides on Glucose Metabolism and Their Antioxidant Activities in vitro

WANG Qiang1, WANG Rui1, WANG Cun1, LONG Jie2
(1.Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 2. Academic Administration of Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

The purpose of this study was to investigate the hypoglycemic activity of polysaccharides isolated from mulberry (MBPs) on streptozotocin-induced diabetes in rats and their antioxidant activity in vitro. Their scavenging activities for hydroxyl and superoxide anion radicals in vitro were determined. The results showed that the EC50values of MBPs for hydroxyl and superoxide anion radical scavenging were 0.17 and 0.54 mg/mL, respectively. MBPs had a significant improvement on blood glucose levels, serum lipid parameters (triglyceride, total cholesterol, low density lipoproteincholesterol (LDL-C), high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)), lipid peroxidation (malondiadehyde content) and serum antioxidant status (glutathione-peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), total antioxidant capacity (T-AOC)) in diabetic rats. This study may provide experimental evidence for the development of antihyperglycemic agent from mulberry polysaccharides.

mulberry polysaccharides; diabetes; glucose metabolism; antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630（2014）11-0260-05

10.7506/spkx1002-6630-201411052

2013-06-30

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（KJTD201325）

王強(qiáng)（1982—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)榭寡趸匀毁Y源利用與生理生化。E-mail：gogo1443@sina.com