抗性淀粉對SD大鼠的胃損傷預(yù)防效果研究

騫 宇，趙 欣*

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067）

抗性淀粉對SD大鼠的胃損傷預(yù)防效果研究

騫 宇，趙 欣*

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067）

以抗性淀粉（RS2）為研究對象，構(gòu)建動(dòng)物模型，通過酶聯(lián)免疫法、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法研究其對HCl-乙醇誘導(dǎo)SD大鼠胃損傷的預(yù)防效果。結(jié)果表明：10% R S2、15% RS2 和20% RS2均能降低大鼠 的血清IL-6和TNF- α水平，大鼠的胃 損傷程度，顯著提高胃損傷的抑制率，均能減少胃液分泌量、增加胃液pH值，表現(xiàn)出一定的胃損傷預(yù)防效果。其中20% R S2對胃損傷預(yù)防效果最佳。

抗性淀粉；胃損傷；HCl-乙醇誘導(dǎo)；血清IL-6細(xì)胞因子；血清TNF-α細(xì)胞因子

根據(jù)“歐洲抗性淀粉研究協(xié)作網(wǎng)（European Flair Conce rted Action on Resistant Starch，EURESTA）”和Englyst[1]的研究結(jié)果，聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）對抗性淀粉做出定義，即“在健康者小腸中不被吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物的總稱”[2]。目前，根據(jù)酶解抗性和淀粉來源等條件將抗性淀粉主要分為4類[3]，即RS1物理包埋淀粉、RS2抗性淀粉顆粒、RS3老化淀粉、RS4化學(xué)改性淀粉。在這4類抗性淀粉中，RS2是目前研究的重點(diǎn)，是最主要的抗性淀粉，具有極大的開發(fā)潛力和商業(yè)價(jià)值。含有豐富的抗性淀粉的食品具有控制體質(zhì)量、降低血糖血脂、預(yù)防結(jié)、直腸癌等多種功能，吸引了眾多學(xué)者的研究興趣，成為近年來國際食品研究的新興領(lǐng)域[4-6]。目前對抗性淀粉的研究主要集中在測定方法及制備技術(shù)的改進(jìn)、物理化學(xué)性質(zhì)與生理功能的關(guān)系、體內(nèi)外消化水平以及在食品中的應(yīng)用等多方面，但其對胃損傷方面的影響還缺乏研究數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建胃損傷SD大鼠模型，研究10%、15%和20%這3個(gè)添加量的RS2對HCl-乙醇誘導(dǎo)引起的胃損傷的預(yù)防、治療作用，為預(yù)防治療乙醇對胃組織損傷提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以期為進(jìn)一步研究開發(fā)富含RS2的保健品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HylonⅦ（含53% RS2）來源于高直鏈玉米淀粉美國國民淀粉公司；預(yù)糊化玉米淀粉 浙江欣欣生化科技有限公司。

無水乙醇、鹽酸、37%福爾馬林、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉 成都市科龍化工試劑廠；細(xì)胞因子TNF-α、細(xì)胞因子IL-6 Biolegend公司；Trizol總RNA抽提劑 美國Invitrogen公司；脫氧核糖核酸酶 瑞士Roche公司；RNeasy 德國Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物 德國Eppendorf公司。

DU-70型紫外分光光度計(jì) 美國Beckman公司；ServenEasy pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；低溫離心機(jī)德國Sigma公司；T100 PCR儀 美國Bio-Rad公司；JS-Power 600電泳儀、JS-680D凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司。

1.2 動(dòng)物

SPF級SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，雄性，6 周齡，共30 只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號為：SYXK（渝）2012-0001。大鼠喂養(yǎng)5d適應(yīng)基礎(chǔ)飼料后，按照體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為：正常組、胃損傷對照組、10% RS2組、15% RS2和20% RS2組，每組6 只，單只飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，在相對濕度（50±10）%，室溫（24±2）℃，12 h明暗輪換（8：00—20：00照明）條 件下飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期間，正常組和胃損傷對照組大鼠喂食不含RS的基礎(chǔ)飼料，RS組大鼠自由采食含有10% RS2、15% RS2和20% RS2的飼料。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠自由攝食和飲水，實(shí)驗(yàn)期4周。飼料每3 d配1 次，置4 ℃冰箱保存。

實(shí)驗(yàn)最后1 d所有大鼠禁食12 h，保持大鼠自由飲水，然后除正常組外所有大鼠進(jìn)行口腔灌胃1 mL的150 mmol/L HCl-乙醇（V（HCl）∶V（乙醇）=2∶3）誘導(dǎo)劑，建立胃損傷大鼠模型。1h后處死所有大鼠并解剖。

1.3.2 大鼠飼料配方

以美國AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)配制實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)飼料[7]，并作為對照組飼料，對照組飼料中的淀粉使用預(yù)糊化玉米淀粉。分別用RS2替代基礎(chǔ)飼料中相應(yīng)量的預(yù)糊化玉米淀粉，使RS2在整個(gè)飼料中所占的比例為10%、15%和20%，飼料其他成分與對照組的飼料相同。各組飼料具體配方見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料的組成Table1 Ingredients of experimental diets g/kg

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 血 清中細(xì)胞因子IL-6和TNF-α測定[8]

采用酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定。大鼠用乙醚麻醉后斷頭處死，從頸部取2 mL血，裝在有抗凝劑的采血 管中，置于冰上，并在4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上層血清于2 mL離心管中，采用定量酶聯(lián)檢測試劑盒，按說明操作。用紫外分光光度計(jì)在450 nm波長處檢測血清中細(xì)胞因子IL-6和 TNF-α水平。

1.3.3.2 胃損傷程度測定[9]

將大鼠的胃組織取出，用10%福爾馬林溶液固定，相機(jī)拍照后用軟件Image J計(jì)算各組大鼠胃組織胃黏膜損傷面積。

1.3.3.3 胃液量和胃液pH值測定

取出大鼠胃組織中的胃液，用量筒測定胃液量，pH計(jì)測定pH值。

1.3.3.4 RT-PCR分析胃組織炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平

用TRIzol總RNA抽提劑制備胃組織總RNA。定量分離到RNA后，以O(shè)ligo dT為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下制備ss cDNA，然后以該cDNA為模板，RT-PCR法擴(kuò)增一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）基因。持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenas e（GAPDH）作為內(nèi)參照物（表2）[10]。

表2 RT-PCR引物序列Table2 Primers of RT-PCR

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS 19.0版本軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為±s，正常組和胃損傷對照組應(yīng)采用t檢驗(yàn)，而胃損傷對照組和其他RS2組采用One-Way ANOVA進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RS2對胃損傷大鼠血清細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平的影響

圖1 RS2對HCl-乙醇誘導(dǎo)胃損傷大鼠血清細(xì)胞因子IL-6 （A）和TNF-TNF-α（B）水平的影響Fig.1 Effect of RS2 on serum IL-6 (A) and TNF-α (B)(B) levels in rats with HCl-ethanol-induced gastric injury

在實(shí)驗(yàn)最后1d大鼠用乙醚麻醉后斷頭，取血清測定IL-6和TNF-α水平，乙醚作為一種麻醉劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)被證明具有安全可靠性，對血液中各項(xiàng)指標(biāo)不會(huì)產(chǎn)生影響[11]，適于本實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)有研究表明酒精灌胃后在短時(shí)間內(nèi)能對動(dòng)物血液中指標(biāo)產(chǎn)生影響，包括IL-6和TNF-α水平[12-13]，胃損傷誘導(dǎo)劑HCl-乙醇對大鼠灌胃后能通過測定血清中IL-6和TNF-α水平來觀察炎癥程度，由此可確定胃損傷情況。由圖1可知，相對于正常組，胃損傷對照組的細(xì)胞因子IL-6和TNF-α水平極顯著增加（P＜0.01）；而10% RS2、15% RS2和20% RS2組均能不同程度的降低血清IL-6和TNF-α水平，其中20% RS2組達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

腸道在受到嚴(yán)重創(chuàng)傷或應(yīng)激狀態(tài)的情況下，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，腸道吸收內(nèi)毒素的能力超過機(jī)體自身清除內(nèi)毒素能力；腸道內(nèi)大量的內(nèi)毒素進(jìn)入血液；釋放出TNF-α、IL-1、血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、IL-6等一系列毒性介質(zhì)，而這些毒性介質(zhì)會(huì)使組織細(xì)胞供氧受到破壞，使腸黏膜的循環(huán)受到影響，最后引起胃組織損傷[14-15]。IL-6和TNF-α炎癥細(xì)胞因子水平降低表示炎癥程度降低[16]。在臨床上常用測定IL-6和TNF-α這兩種常見的炎性細(xì)胞因子水平來判定胃炎的程度[10,17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種添加量的RS2組均能不同程度的降低血清IL-6和TNF-α水平，降低胃損傷程度，其中20% RS2組的效果最顯著。

2.2 RS2對胃損傷大鼠胃損傷水平的影響

圖2 RS2對HCl-乙醇誘導(dǎo)胃黏膜損傷大鼠的胃外觀觀察Fig.2 Effect of RS2 treatment on stomach appearance of rats with HCl-ethanol-induced gastric injury

由圖2可知，相對于正常組，胃損傷對照組大鼠的胃部黏膜可見明顯的條狀出血和糜爛，而10% RS2、15% RS2和20% RS2組大鼠胃部黏膜的條狀出血和糜爛面積均明顯小于胃損傷對照組，其中20% RS2組大鼠胃部黏膜損傷最小。

表3 RS2治療HCl-乙醇誘導(dǎo)胃損傷大鼠的胃損傷程度Table3 Gastric injury levels of HCl-ethanol-induced gastric injury in rats with RS2 treatment

由表3可知，胃損傷對照組大鼠的胃損傷程度明顯高于各RS2組，達(dá)顯著水平（P＜0.05）。各RS2組大鼠的胃損傷程度均顯著低于胃損傷對照組（P＜0.05），而抑制率顯著高于胃損傷對照組大鼠（P＜0.05），其中20% RS2組效果達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。可能是由于在HCl-乙醇誘導(dǎo)SD大鼠胃損傷前，已經(jīng)喂食不同含量的RS2才使得各RS2組大鼠的胃損傷程度相對于胃損傷對照組均有一定程度下降。由此可知，RS2對胃損傷具有一定的預(yù)防作用，其中20% RS2組效果最顯著。

2.3 RS2對胃損傷大鼠的胃液量和胃液pH值的影響

胃損傷出現(xiàn)時(shí)，胃液分泌量會(huì)增加，同時(shí)胃液正常pH值也會(huì)降低[18]。由圖3A可知，相對于正常組，胃損傷對照組的胃液分泌量極顯著增加（P＜0.01）。10% RS2、15% RS2和20% RS2組大鼠的胃液分泌量均低于胃損傷對照組，其中20% RS2組達(dá)顯著水平（P＜0.05）。由圖3B可知，相對于正常組，胃損傷對照組的胃液pH值極顯著降低（P＜0.01）。10% RS2、15% RS2和20% RS2組均均能增加胃液pH值，其中20% RS2組達(dá)顯著水平（P＜0.05），由此可知RS2對胃損傷具有一定的預(yù)防作用，其中20% RS2對胃損傷的預(yù)防作用最強(qiáng)。

圖3 RS2對HCl-乙醇誘導(dǎo)大鼠的胃液量（A）和胃液pH值（B）的影響Fig.3 Effect of RS2 treatment on gastric secretion vo lume (A) and gastric juice pH (B) in HCl/ethanol-induced gastric injury model rats

2.4 RS2對胃損傷大鼠的胃組織炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

圖4 RS2對HCl-乙醇誘導(dǎo)大鼠胃組織的iNOS、COX-2、TNF-α和IILL--11β mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of RS2 treatment on mRNA expression levels of iNOS, COX-2, TNF-α and IL-1β in the stomach tissues of HCl-ethanol-induced gastric injury model rats

急性酒精灌胃后能對大鼠的胃黏膜造成明顯的損傷，損傷會(huì)在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生炎癥的反應(yīng)，由此動(dòng)物組織中的炎癥表達(dá)產(chǎn)生變化，是胃損傷效應(yīng)的標(biāo)志之一[19]，HCl-乙醇誘導(dǎo)劑能增強(qiáng)影響作用[20]。由圖4可知，在化學(xué)試劑誘導(dǎo)SD大鼠胃損傷前，喂食10% RS2、15% RS2和20% RS2組大鼠的胃組織的炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)均明顯低于胃損傷對照組大鼠，其中20% RS2組大鼠胃組織的炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)最接近正常組大鼠，對胃損傷具有最好的預(yù)防效果。

一氧化氮合酶（iNOS）是鈣離子和鈣調(diào)蛋白非依賴性酶，僅在炎癥時(shí)表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者炎癥部位腸黏膜細(xì)胞出現(xiàn)iNOS表達(dá)，而非炎癥部位腸黏膜無iNOS表達(dá)[21]。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥等刺激時(shí)COX-2可大量表達(dá)，與機(jī)體的發(fā)熱、疼痛、損傷及腫瘤等關(guān)系密切，是炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞毒性重要的決定因素之一[22]。TNF-α、IL-1β是促炎細(xì)胞因子，IL- 1β含量和活性的增加快，而且持續(xù)炎癥的整個(gè)過程，TNF-α偏重組織的損傷[23]。有研究表明，在胃損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，隨著胃損傷程度的增加，iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β表達(dá)均明顯增強(qiáng)[24]。本研究也得到相似的結(jié)論，在所有5組大鼠中，胃損傷對照組大鼠的iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β炎癥表達(dá)最強(qiáng)，10% RS2、15% RS2和20% RS2組大鼠的炎癥表達(dá)均弱于胃損傷對照組，其中20% RS2組降低效果最明顯，說明RS2在化學(xué)劑誘導(dǎo)大鼠胃損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中能降低TNF-α、IL-1β表達(dá)強(qiáng)度，對減輕胃損傷起重要作用。

3 結(jié) 論

從大鼠的血清細(xì)胞因子水平、胃損傷程度、胃液分泌量、胃液pH值和胃組織炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)一系列指標(biāo)得出結(jié)論，10% RS2、15% RS2和20% RS2組均對化學(xué)誘導(dǎo)的SD大鼠的胃損傷具有一定的預(yù)防、改善效果，其中20% RS2效果最明顯。

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Preventive Effect of Resistant Starch on Gastric Lesions in Rats

QIAN Yu, ZHAO Xin*
(Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

Rats were fed on a basal diet supplemented different levels of high-amylose corn starch (Hylon Ⅶ) to explore the effect of resistant starch on hydrochloric acid/ethanol-induced gastric lesions in rats using ELISA and reverse transcription-PCR (RT-PCR). The results showed that 10% RS2, 15% RS2 and 20% RS2 groups could reduce serum IL-6 and TNF-α levels and gastric lesion area, and significantly increase the inhibition rate of gastric lesions when compared with the stomach injury control group. In addition, these three concentrations of RS2 could decrease the secretion of gastric juice, and increase gastric pH. These results suggest that RS2 at the three concentration levels has a significant preventive effect on hy drochloric acid/ethanol-induced gastric lesions in rats a nd 20% RS2 is the most effective level.

resistant starch; gastric lesions; hydrochloric acid/ethanol-induced; serum IL-6; s erum TNF-α

TS2 01.4

A

1002-6630（2014）11-0241-05

10.7506/spkx1002- 6630-201411048

2013-07-22

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（KJTD201325）；重慶第二師范學(xué)院教改項(xiàng)目（JG2014217）

騫宇（1976—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：qianyu@live.com

*通信作者：趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)、食品生物技術(shù)。E-mail：foods@live.cn