不同黃酮類單體對CHO 細(xì)胞早期損 傷作用的比較研 究

劉 濤，孫 健，郭 辰，趙曉紅,*

（1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2.北京聯(lián)合大學(xué)功能食品研究 院，北京 100191）

不同黃酮類單體對CHO 細(xì)胞早期損 傷作用的比較研 究

劉 濤1，孫 健2，郭 辰2，趙曉紅2,*

（1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2.北京聯(lián)合大學(xué)功能食品研究 院，北京 100191）

選用竹葉中4 種黃酮單體葒草苷、異葒草苷、綠原酸和阿魏酸，在各毒性劑量下作用于中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞，通過檢測其對細(xì)胞早期損傷指標(biāo)——線粒體功能變化的影響，以評估其細(xì)胞損傷作用。CCK-8檢測法測得4 種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞的IC50值分別是：綠原酸2 726.11 μmol/L、阿魏酸1 680.28 μmol/ L、葒草苷1 889.15 μmol/L、異葒草苷2 358.56 μmol/L。在各單體IC50、1/2 IC50值、1/4 IC50值、1/8 IC50值劑量下，線粒體膜電位變化具有劑量依賴性，其中以阿魏酸降低幅度最明顯，綠原酸次 之，葒草苷和異葒草苷變化較??；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成量與作用劑量成負(fù)相關(guān)，阿魏酸致ATP生成量降低最多，葒草苷次之，綠原酸和異葒草苷影響較??；細(xì)胞色素 C的釋 放量，以阿魏酸最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸的最小。研究表明4種單體物質(zhì)都對線粒體產(chǎn)生了一定的損傷，其中阿魏酸對線粒體影響最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸最小。

細(xì)胞色素C；線粒體膜電位；三磷酸腺苷；線粒體損傷；綠原酸；阿魏酸；葒草苷；異葒草苷

竹葉提取物是我國新開發(fā)的一類資源，其主要的生理活性成分包括竹葉黃酮及其苷類、活性多糖、礦物質(zhì)及茶多酚等[1]。竹葉黃酮是由黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物組成的混合物，其中黃酮類的代表物質(zhì)是葒草苷、異葒草苷，內(nèi)酯類的代表物質(zhì)是綠原酸、咖啡酸和阿魏酸等，這些單體物質(zhì)都具有多方面的活性[2]。大量流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明竹葉黃酮具有抗炎、抗氧化、防腐抗菌、預(yù)防動脈粥樣硬化等生物活性，尤其對于腫瘤的抑制具有顯著作用[3-8]。

目前關(guān)于葒草苷、異葒草苷、綠原酸和阿魏酸這4種單體物質(zhì)的研究主要集中在它們有益的一面，對于有害一面的毒性評價研究資料較少，而在毒劑量下作用于正常細(xì)胞的早期損傷指標(biāo)的研究更是未見報道。研究植物活性物質(zhì)毒性，常用的方法主要為常規(guī)毒性評價方法和早期細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。常規(guī)毒性評價方法主要為動物實(shí)驗(yàn)，如急性毒性、小鼠微核實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)等，早期細(xì)胞反應(yīng)研究可預(yù)測體內(nèi)毒性反應(yīng)，如細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、酶活性變化、線粒體損傷。

在細(xì)胞中，線粒體不僅是能量提供中心，而且具有其他多種重要的生理功能，如控制中間代謝，鈣離子穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞增殖生長與凋亡等[9-10]。細(xì)胞的凋亡和生長的過程均需要能量，線粒體是機(jī)體產(chǎn)生能量的重要場所，細(xì)胞進(jìn)行生命活動95%的能量來源于它。DNA的損傷造成復(fù)合酶的活性下降，直接導(dǎo)致ATP生成減少[11]。胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生大多數(shù)來源于線粒體，當(dāng)ROS增加并超出臨界值時，就導(dǎo)致膜通透性的改變、膜間因子和膜上各種蛋白的釋放，從而引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或死亡。存在于膜間的Cyt C是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中不可缺少的重要因子，在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[12]。

當(dāng)前對于線粒體損傷的檢測手段多種多樣。采用電鏡實(shí)驗(yàn)觀察線粒體異常時的嵴型變化、基質(zhì)凝縮等情況[13-14]；聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和核酸雜交（Southern blotting）檢測mtDNA缺失突變[15-16]；對線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的檢測方法有膜片鉗技術(shù)法、活性物質(zhì)標(biāo)記法、分光光度法等[17]；線粒體膜電位的變化檢測可以采用JC-1探針[18]；ROS的檢測主要采用四大類方法：化學(xué)發(fā)光法、熒光探針、電子自旋共振和分光光度法[19]；目前對于ATP的檢測主要采用生物熒光技術(shù)，該法根據(jù)熒光素、熒光素酶在ATP作用下，發(fā)生熒光反應(yīng)，利用熒光光度計(jì)檢測其發(fā)光強(qiáng)度[20]。

本實(shí)驗(yàn)采用黃酮類4種單體物質(zhì)綠原酸、阿魏酸、葒草苷和異葒草苷作用于CHO細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)得到細(xì)胞存活率，計(jì)算出IC50值，以IC50值為毒性劑量上限，倍比稀釋后，1/2 IC50值、1/4 IC50值、1/8 IC50值劑量為實(shí)驗(yàn)濃度，作用細(xì)胞24h后，檢測毒性劑量下4種單體對CHO細(xì)胞線粒體損傷以及細(xì)胞凋亡的影響，并比較4種單體的線粒體毒性以及發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷的早期指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸、阿魏酸、葒草苷和異葒草苷 美國Sigma公司；CHO細(xì)胞株 美國GE Healthcare公司；F-12 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；青鏈霉素（Penicillin-Streptomycin，PS）、胰蛋白酶（0.25% trypsin） 美國Invitrogen公司；CCK-8 日本Dojindo公司；ROS檢測試劑盒 中國普利萊基因有限公司；ATP檢測試劑盒 中國碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 中國寶賽生物技術(shù)有限公司；Cytochorme C單克隆抗體 中國博奧森有限公司；羰酰氰氯苯腙（carbonylcyanidem-chlorophen- ylhydrazone，CCCP） 美國Alfa Aesar公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺 北京百劍空氣凈化設(shè)備廠；Forma 3110系列CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司；TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；MLS-3750型高溫蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；5840R冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司；MQX200微板分光光度計(jì) 美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞增殖率測定

Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞活性檢測試劑中包括有WST-8，在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxy PMS）的作用下，細(xì)胞線粒體中的脫氫酶可以將WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan）。反應(yīng)生成的甲瓚產(chǎn)物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。采用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其OD值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

取指數(shù)生長期的CHO細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后，以5×104個/mL的細(xì)胞密度，接種于96 孔培養(yǎng)板（100μL/孔），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄上清，用PBS液洗1～2遍，加入90 μL/孔不含小牛血清的各濃度的樣品（實(shí)驗(yàn)組），每個濃度設(shè)6 個平行，培養(yǎng)24 h；設(shè)置不加樣品的對照組。直接向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，輕輕混勻（注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD值讀數(shù)，造成結(jié)果誤差）；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h；用MQX200微孔板分光光度計(jì)檢測激發(fā)波長為450nm的每孔的OD值。以無細(xì)胞的CCK-8溶液為空白組。按下式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.2 線粒體膜電位的檢測

JC-1是一種廣泛用于線粒體膜電位檢測的陽離子脂質(zhì)熒光染料，可以很好的指示膜電位的變化。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，當(dāng)線粒體膜電位較低時，它以單體的形式存在；當(dāng)膜電位較高時，它以多聚體形式存在。單體的最大激發(fā)波長為514 nm，最大發(fā)射波長為529 nm，可采用流式細(xì)胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光；多聚體的最大激發(fā)波長為535 nm，最大發(fā)射波長為590 nm，可被流式細(xì)胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到熒光。

操作同流式細(xì)胞儀凋亡檢測，收集細(xì)胞，然后每管加入100 μL JC-1染色液，輕輕彈動離心管至均勻后，室溫避光孵育20 min；孵育結(jié)束后每管加入500 μL的PBS緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測各組JC-1的熒光強(qiáng)度，每個樣本收集10 000 個細(xì)胞進(jìn)行分析，CCCP作為陽性誘導(dǎo)劑處理正常細(xì)胞；數(shù)據(jù)采用Cell Quest TM軟件分析，結(jié)果以FL2/FL1（紅/綠熒光）的比值表示。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)ATP的檢測

同上收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒操作說明書處理細(xì)胞，將裂解液在冰上完全裂解細(xì)胞后，13 000 r/min，離心10 min；離心過后的樣品置于冰上放置，取96 孔板在每孔內(nèi)加入100 μL試劑盒內(nèi)的ATP檢測緩沖液，靜置5 min；取上清細(xì)胞裂解液，10 μL每孔加入到緩沖液內(nèi)，同時檢測不同組的蛋白濃度；迅速的采用熒光酶標(biāo)儀檢測，記錄讀數(shù)，計(jì)算出每組ATP的量（μmol/μg），結(jié)果以空白組為1，其余各組用與空白組相對比較值表示。

1.3.4 Western blotting檢測細(xì)胞色素C的表達(dá)

分別采用 4種單體物質(zhì)不同濃度的IC50、1/2 IC50、1/4 IC50、1/8 IC50值處理CHO細(xì)胞24h后，采用Western blotting檢測胞內(nèi)細(xì)胞色素C的濃度。在將細(xì)胞按要求處理過后，分組為空白組、陽性對照組和4 種單體不同IC50值組。4 種單體處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，4 ℃、800～1 000 r/min，離心5 min，棄去上清液，沉淀加入含有PMSF的裂解液，混勻細(xì)胞，于冰上裂解30 min，快速的4 ℃下13 000 r/min離心15 min，得到的上清液加入上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。加入封閉液（1×PBST中加入5 g/100 mL的BSA），室溫?fù)u床下封閉PVDF膜1h；加入Cyt C一抗4℃孵育過夜，PBST洗脫3 次，再與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBST洗脫3 次，ECL發(fā)光液反應(yīng)，顯影。應(yīng)用ImageQuant RT ECL凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖像后，Quantity One軟件進(jìn)行分析，以細(xì)胞色素C與β-actin蛋白條帶的灰度值之比作為指標(biāo)，再以空白對照組的灰度值得出目的蛋白表達(dá)相對于內(nèi)參的定量結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS17.0進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果用±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組均數(shù)比較；各樣品濃度與對照組比較采用單因素方差分析中的Dunnetts檢驗(yàn)；IC50值采用回歸中概率單位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞增殖率的影響

表1 不同濃度的4種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞增殖率的影響（x±s，n=3）Table1 Effect of four substances at different concentrations on the viability of CHO cellss (x ±s，nn == 33))

4 種單體物質(zhì)作用于CHO細(xì)胞24 h后，CCK-8檢測后計(jì)算得出4 種單體物質(zhì)的IC50值分別是：綠原酸2 726.11 μmol/L、阿魏酸1 680.28 μmol/L、葒草苷1 889.15 μmol/L、異葒草苷2 358.56 μmol/L。由此可以看出，4種單體物質(zhì)的細(xì)胞毒性都不大。由表1可知，隨著劑量的加大，細(xì)胞增殖率下降，濃度小于800 μmol/L時葒草苷處理組細(xì)胞增殖率最低；大于800 μmol/L時阿魏酸最低。IC50值越小，細(xì)胞毒性越大；增值率越大，細(xì)胞毒性越小。因此，可以得出這4 種單體物質(zhì)中阿魏酸的CHO細(xì)胞毒性作用最大，綠原酸的最小。

2.2 不同劑量的4種單體對CHO細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖1 不同劑量下4種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.1 Effects of four substances at various doses on mitochondrial membrane potential of CHO cells

由圖1可知，由JC-1染色的細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀收集分析，得到的散點(diǎn)圖包括4個象限。染色后收集細(xì)胞采用紅色的FL-2通道，線粒體膜電位較高時，細(xì)胞處于右上象限，膜電位下降的細(xì)胞處于右下象限，兩者的熒光比值就可以反應(yīng)出受損細(xì)胞線粒體膜電位的下降情況。

圖2 不同劑量下4種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞線粒體膜電位影響的比較Fig.2 Effects of four substances at various doses on mitoc hondrial membrane potential of CHO cells

由圖2可知，阿魏酸對膜電位的影響最大，綠原酸次之，葒草苷與異葒草苷的最小，單因素方差分析4種單體在各毒性劑量下的比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同劑量下4種單體處理的CHO細(xì)胞線粒體膜電位變化（x±s，n=3）Table2 Change in mitochondrial membrane potential of CHO cells treated with four substances at various doses(x ±s，nn == 33))

由表2可知，4種單體物質(zhì)在各自的IC50值濃度下處理CHO細(xì)胞24h后，熒光比值與空白組比較，阿魏酸呈極顯著差異，綠原酸、葒草苷和異葒草苷呈顯著性差異；在1/2 IC50值濃度處理下，阿魏酸呈顯著性相關(guān)，其他3種單體無顯著性差異；隨著濃度的下降，4種單體物質(zhì)處理細(xì)胞，對其線粒體膜電位影響與空白組均無顯著性差異。

2.3 不同劑量的4種單體對CHO細(xì)胞內(nèi)ATP的影響

圖3 不同劑量下4種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞內(nèi)ATP相對含量的影響Fig.3 Effects of four substances at various doses on ATP levels of CHO cells

由圖3可知，不同濃度的4種單體物質(zhì)作用于CHO細(xì)胞24h后，與空白組比較，胞內(nèi)ATP的生成量減少，隨濃度的降低，胞內(nèi)ATP量增多，但均小于空白組。在IC50值濃度下，阿魏酸作用于細(xì)胞生成的ATP最少，相對比值為0.64，葒草苷為0.75，它們與空白組比較均呈極顯著性差異；綠原酸的最大為0.85，異葒草苷為0.81，它們與空白組比較呈顯著性差異；濃度降至各自的1/4 IC50時候，4種單體作用產(chǎn)生的ATP與空白組比較無顯著性差異。由此可知，4種單體物質(zhì)在毒性劑量下對胞內(nèi)ATP的影響，阿魏酸的最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸的最小。通過單因素方差分析比較，IC50劑量下阿魏酸與綠原酸呈極顯著差異（P<0.01），與異葒草苷有顯著性差異（P<0.05），與葒草苷無顯著性差異（P＞0.05），1/2與1/4 IC50劑量下4種單體之間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 不同劑量的4種單體對CHO細(xì)胞細(xì)胞色素C的影響

圖4 不同劑量下4種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的影響Fig.4 Effects of four substances at various doses on cytochrome C release of CHO cells

圖5 不同劑量下4種單體物質(zhì)對CHO細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的影響Fig.5 Effects of four substances at various doses on cytochrome C release of CHO cells

由圖4、5可知，不同濃度的4種單體物質(zhì)處理CHO細(xì)胞24h后，對細(xì)胞色素C的釋放具有不同的影響。綠原酸與異葒草苷的IC50、1/2 IC50、1/4 IC50、1/8 IC50下處理，與空白組比較均無顯著性差異；阿魏酸IC50濃度處理下與空白組比較具有極顯著差異，1/2 IC50濃度處理下具有顯著性差異，其余處理無差異；葒草苷在IC50濃度處理下與空白組比較具有顯著差異，其余＜濃度組處理無顯著性差異。由此可知，4種單體作用后細(xì)胞色素C釋放量，阿魏酸最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸的最小，且4種單體物質(zhì)在相同毒性劑量下相互比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)探討了4種黃酮單體葒草苷、異葒草苷、綠原酸和阿魏酸對細(xì)胞早期損傷指標(biāo)——線粒體功能變化的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4種單體物質(zhì)處理CHO細(xì)胞24h后，在1/4 IC50值濃度下與空白組比較各線粒體損傷指標(biāo)變化都無顯著性差異；在1/2 IC50值濃度下細(xì)胞色素C釋放與空白組比較無顯著性差異，膜電位變化，阿魏酸呈顯著性差異，其他單體無顯著性差異，ATP的下降阿魏酸和葒草苷呈顯著性差異，其他無顯著性差異，說明相同劑量下，ATP的變化在反應(yīng)線粒體損傷方面比膜電位和細(xì)胞色素C的釋放更敏感。

氧化磷酸化發(fā)生的主要場所是線粒體，因此線粒體與ATP的合成關(guān)系密切。在一些外界因素刺激下，細(xì)胞中會出現(xiàn)大量過氧化物的積累，過多的氧自由基，使細(xì)胞及線粒體出現(xiàn)膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致線粒體受損，功能異常，ATP生成小于分解，進(jìn)一步的反應(yīng)還會使膜磷脂分解[21]。線粒體膜電位、ROS和ATP的變化說明了是線粒體損傷后造成了這一系列的結(jié)果，因?yàn)樗鼈冎g存在相互關(guān)聯(lián)，這與以往文獻(xiàn)[21-22]報道相一致。

作為胞內(nèi)的能量工廠，90%的ATP通過氧化磷酸化在此產(chǎn)生。在這個過程中，氧化呼吸鏈障礙會造成“電子漏”，生成的O2會被氧化成超氧陰離子，因此它是胞內(nèi)大多數(shù)ROS的來源。另一方面，存在于氧化呼吸鏈上的細(xì)胞色素C負(fù)責(zé)將電子由復(fù)合物Ⅲ傳遞到復(fù)合物Ⅳ[23]，細(xì)胞色素C的結(jié)果可以看出不同劑量處理改變并沒有其他指標(biāo)那么明顯，這或許是因?yàn)樗尼尫啪哂衅渌目刂埔蛩?，同時它的釋放在ROS產(chǎn)生，以及ATP下降之后，但是從凋亡結(jié)果仍可以看出線粒體損傷參與了CHO細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)第一次比較了4種黃酮類單體的線粒體毒性，得出結(jié)論為：阿魏酸的線粒體毒性最大，綠原酸的最小。線粒體相關(guān)指標(biāo)與細(xì)胞凋亡率的比較看出，這4種物質(zhì)作用于CHO 細(xì)胞后，線粒體調(diào)控了凋亡的發(fā)生，它們不僅僅導(dǎo)致了ROS的過量產(chǎn)生，還引起了ATP、膜電位的下降和細(xì)胞色素C的增多，然后通過凋亡等反應(yīng)去應(yīng)對線粒體損傷造成的各種細(xì)胞功能障礙。

線粒體與細(xì)胞凋亡之間存在著千絲萬縷的聯(lián)系，線粒體膜電位、ATP、細(xì)胞色素C的這些變化當(dāng)不處于細(xì)胞所能調(diào)控的范圍之內(nèi)，細(xì)胞將啟動保護(hù)功能除去這些受損的線粒體甚至細(xì)胞，以保證組織和機(jī)體的正常生命活動，但是目前的一些探索也僅僅只是停留在淺層，相互之間更深的聯(lián)系還有待進(jìn)一步的研究。

[1] 夏玉紅, 董晉文, 鐘耕. 竹葉提取物的研究開發(fā)現(xiàn)狀[J]. 中國食品添加劑, 2009(2): 77-83.

[2] 梅晶, 祖桂芳, 趙曉紅, 等. 北京早園竹葉不同提取組分對CHO細(xì)胞Akt信號通路的影響[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(3): 248-252.

[3] THEODORATOU E, KYLE J, CETNARSKYJ R, et al. Dietary flavonoids and the risk of colorectal cancer[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention, 2007, 16(4): 684-693.

[4] TAVANI A, SPERTINI L, BOSETTI C, et al. Intake of specific f avonoids and risk of acute myocardial infarction in Italy[J]. Public Health Nutrition, 2006, 9(3): 369-374.

[5] ZHANG Ge, QIN Ling, SHI Yinyu. Epimedium derived phytoestrogen flavonoids exert beneficial effect on preventing bone loss in late postmenopausal women: a 24 month randomized, double blind and placebo controlled trial[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2007, 22(7): 1072-1079.

[6] PHAM V H, NAOFUMI M. Distribution of phenolic compounds in the graded flours milled from whole buckwheat grains and their antioxidant capacities[J]. Food Chemistry, 2008, 109(2): 325-331.

[7] MATSUDA H, YOSHIDA K, MIYAGAWA K, et al. Rotenoids and flavonoids with anti invasion of HT1080, anti proliferation of U937, and differentiation inducing activity in HL-60 from Erycibe expansa[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2007, 15(3): 1539-1546.

[8] KOOK S H, SON Y O, JANG Y S, et al. Inhibition of c-Jun N terminal kinase sensitizes tumor cells to f avonoid induced apoptosis through down regulation of JunD[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2008, 227(3): 468-476.

[9] OAKES S A, KORSMEYER S J. Untangling the web: mitochondrial fssion and apoptosis[J]. Developmental Cell, 2004, 7(4): 460-462.

[10] CHEN H, DETMER S A, EWALD A J, et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development[J]. Journal of Cell Biology, 2003, 160(2): 189-200.

[11] PRONICKI M, SYKU T-CEGIELSKA J, MIERZEWSKA H, et al. Diversity of clinical symptoms in A3243G mitoch ondrial DNA mutation (MELAS syndrome mutation) [J]. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2002, 8(11): 767-7 73.

[12] CAROPPI P, SINIBALDI F. Apoptosis and human diseases: mitochondrion damage and lethal role of released cytochrome C as proapoptotic protein[J]. Current Medi c inal Chemistry, 2009, 16(31): 4058-4065.

[13] 宋東林, 呂強(qiáng), 陳晉文, 等. 線粒體肌病和線粒體腦肌病組織化學(xué)及電鏡的研究[J]. 中國神經(jīng)精神疾病雜志, 1994, 20(1): 19-21.

[14] 姚英民, 歐巧群, 陳瑤. 人類輪狀病毒感染新生小鼠腸道外組織超微結(jié)構(gòu)的變化[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2006, 26(9): 1334-1336 .

[15] HAN Yue, CHEN Junjian Z. Oxidative stress induces mitochondrial DNA damage and cytotoxicity through independent mechanisms in human cancer cells[J]. BioMed Research International, 2013: Article ID 825065, 8 pages.

[16] CHOUTEAU J M, OBIAKO B, GORODNYA O M, et al. Mitochondrial DNA integrity may be a determinant of endothelial barrier properties in oxidant-challenged rat lungs[J]. American Journal of Physiology Lung Cellular Molecular Physiology, 2011, 301(6): 892-898.

[17] 王新, 程鳳玲. 線粒體的功能及檢測方法[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2011, 17(1): 12-17.

[18] 凌子惠, 張思維, 曹怡, 等. 細(xì)胞應(yīng)激條件下嗜熱四膜蟲線粒體膜電位變化研究[J]. 復(fù)旦學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2012, 51(3): 283-291.

[19] ARMSTRONG J S, WHITEMAN M. Measurement of reactive oxygen species in cells and mitochondria[J]. Methods Cell Biology, 2007, 80: 355-377.

[20] 柳雅立, 孫玉, 石英, 等. 細(xì)胞ATP檢測試劑的優(yōu)化及其靈敏度的測定[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程, 2010, 10(11): 2601-2603.

[21] PI Jingbo, BAI Yushi, ZHANG Qiang, et al. Reactive o xygen species as a signal in glucose stimulated insulin secretion[J]. Diabete, 2007, 56(7): 1783-1791.

[22] MA Yuxiang, OGINO T, KAWABATA T, et al. Cupric nitrilotricacetate-induced apoptosis in HL-60 cells association with lipid peroxidation, release of cytochrome C from mitochondrial, and activation of caspase-3[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1999, 27(1/2): 227-233.

[23] 王來栓, 邵肖梅. 線粒體與缺氧缺血性腦細(xì)胞凋亡[J]. 國外醫(yī)學(xué): 腦血管疾病分冊, 2003, 11(1): 65-67.

Comparison of Early Damage of CHO Cells in the Presence of Different Flavonoid Monomers

LIU Tao1, SUN Jian2, GUO Chen2, ZHAO Xiao-hong2,*
(1.School of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China; 2.Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

The cytotoxicity of four types of flavonoid monomers, namely chlorogenic acid, ferulic a cid, orientin and isoorientin on Chinese hamster ovary (CHO) cells wa s detected and compared by CCK-8 test and the IC50values were calculated by Exact Probability. The mitochondrial membrane potential, the production of ATP and the release of cytochrome C were used as the parameters to indicate early cellular damage. The results showed that IC50of chlorogenic acid, ferulic acid, orientin and isoori entin was 2 726.11, 1 680.28, 1 889.15 and 2 358.56 μmol/L, respectively. At experimental doses of IC50, 1/2 IC50, 1/4 IC50, and 1/ 8 IC50for these four monomers, the change of mitochondrial membrane potential was in a dose-dependent manner. Meanwhile, ferulic acid resulted in the largest decease in mitochondrial membrane potential, followed by chlorogenic acid, orientin and isoorientin. The production of ATP was negatively correlated with the dose of f avonoids, which was inhibited by ferulic acid, orientin, chlorogenic acid and isoorientin in this decreasing order. In the case of cytochrome C release, the decreasing order was ferulic acid, orientin, isoorientin and chlorogenic acid. In summary, all the four f avonoids can result in mitochondrial damage at higher or lower levels. Ferulic acid has the highest mitochondrial toxicity, followed by orientin, isoorientin and chlorogenic acid. The change of mitochondrial function may be considered as an index of early cellular damage.

cytochrome C; mitochondrial membrane potential; adenosine triphosphate; mitochondrial damage; chlorogenic acid; ferulic acid; orientin; isoorientin

Q946.8；Q255

A

1002-6630（2014）11-0223-06

10.7506/spkx1002-6630-201411045

2013-10-25

北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ201211417041）

劉濤（1987—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)。E-mail：Lionat711@sina.com

*通信作者：趙曉紅（1961—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称饭δ芘c毒理學(xué)。E-mail：xiaohong@buu.edu.cn