5-氨基乙酰丙酸對蘋果幼果多酚含量、苯丙氨酸解氨酶活性及其基因表達的影響

陳 磊，郭玉蓉，劉永峰*，米瑞芳，竇 嬌

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710062）

5-氨基乙酰丙酸對蘋果幼果多酚含量、苯丙氨酸解氨酶活性及其基因表達的影響

陳 磊，郭玉蓉，劉永峰*，米瑞芳，竇 嬌

（陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710062）

探究5-氨基乙酰丙酸（aminolevulinic acid，ALA）處理對蘋果幼果酚類物質、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）活性及其基因表達量的影響。在蘋果疏果期前，利用不同質量濃度ALA處理蘋果幼果，采用紫外分光光度法測定ALA處理后12 d內蘋果多酚和PAL活性，利用熒光定量法測定蘋果幼果PAL基因表達量。結果表明：ALA處理質量濃度在300 mg/L以內，隨著質量濃度提高，蘋果多酚含量、PAL酶活性及其基因表達量均升高，到400 mg/L時各項指標均表現(xiàn)出下降趨勢；相同質量濃度ALA處理蘋果幼果后，幼果的上述3 項指標均隨時間延長而明顯提高，在第9天時達到最高值，12 d后開始下降。為提高蘋果疏果多酚含量，實現(xiàn)疏果的最大利用率，生產中需要選擇適宜的ALA處理濃度和時間采集幼果。

蘋果幼果；多酚；苯丙氨酸解氨酶；基因表達

多酚類物質是蘋果果實重要功能成分之一，具有抑菌、抗過敏、抗衰老、清除自由基、抗氧化等多種功能[1]。據(jù)報道蘋果幼果多酚含量是成熟果的10 倍，含量高達110～357 mg/100 g新鮮幼果[2]。而蘋果疏果工作是解決座果過量、克服大小年、提高果品質量、實現(xiàn)持續(xù)均衡豐產的必要技術措施。在中國每年有約160萬t的蘋果疏果腐爛在果園里，造成資源的大量浪費[3]。因此，從蘋果幼果中提取蘋果多酚對于充分利用蘋果疏果資源具有重要意義。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）不僅是生物體內合成卟啉化合物的第一個關鍵前體[4]，還參與植物生長發(fā)育的調節(jié)過程。低質量濃度ALA（＜500 mg/L）能通過刺激苯丙烷代謝系統(tǒng)而提高植物多酚含量[5-6]，也可以增強植物抗逆性[7]。苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-1yase，PAL）普遍存在于高等植物中，是苯丙烷類代謝的關鍵酶[8]。相關報道指出PAL活性不僅與植物多酚含量成正比[9]，還與植物果實著色[10]、褐變[11-12]及抗逆性[13-14]等密切相關。因此，本實驗擬通過ALA處理蘋果疏果期前期的幼果，研究蘋果幼果多酚含量的變化與PAL活性的關系，從影響蘋果PAL基因表達層面探究蘋果幼果多酚的變化規(guī)律，從而提高蘋果疏果中多酚的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇陜西省咸陽市禮泉縣蘋果綜合實驗站的10年生“長富2號”蘋果樹，在蘋果疏果期前20 d（2013年4月15 日），挑選5 株10 年生、樹勢接近的果樹作為實驗樹。分別用質量濃度為100、200、300、400 mg/L的ALA噴灑幼果，噴灑處理后3、6、9、12 d采摘幼果，每株實驗樹（其中1株為對照）每次取幼果20 個，6 個新鮮幼果用來測定多酚，6 個新鮮幼果用來測定PAL酶活性，剩余8 個幼果經液氮速凍后置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

StepOne RT-PCR儀 美國ABI公司；RT-PCR試劑盒 南京金斯瑞生物技術有限公司；反轉錄cDNA試劑盒和熒光染料SYBR 日本TaKaRa公司；其他試劑為國產分析純或化學純；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

UNICO PC2102型紫外-可見光分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；TGL-16G高速低溫離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 幼果總多酚含量的測定

參照任文霞等[15]的方法。蒸餾水洗凈6 個新鮮幼果，濾紙吸干表面水分，粉碎后取1.0 g幼果果肉，加入20 mL 70%乙醇，55 ℃超聲輔助提取4次，定容至100 mL。取1.0 mL提取液加入12 mL飽和NaCO3和1.0 mL福林酚，定容至25 mL。避光反應1 h后，檢測OD765nm值，多酚含量直接用OD765nm表示。

1.4 PAL酶活力的測定

參照林植芳等[16]的方法。蒸餾水洗凈6個新鮮幼果，用濾紙吸干表面水分，粉碎后取0.5 g幼果果肉，加入5 mL 0.05 mol/L pH 8.8的硼酸緩沖液（含0.005 mol/L β-巰基乙醇），然后加入0.1 g 聚乙烯吡咯烷酮和少許石英砂，冰浴下研磨成勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液為酶液，用來測定酶活力。

酶活力測定反應體系：0.02 mol/L L-苯丙氨酸（用0.1 mol/L、pH 8.8的硼酸緩沖液配制）1.0 mL，0.05 mol/L硼酸緩沖液2.0 mL，1.0 mL酶液，30 ℃水浴30 min，測定OD290nm值。每克鮮質量每分鐘所引起吸光度變化 0.00l為1個酶活力單位（U/（min·g））[17]。

1.5 提取蘋果果實總RNA及其反轉錄

取凍存的蘋果幼果，采用改良的CTAB-LiCl法[18]提取蘋果幼果總RNA，用微量紫外分光光度計對RNA的濃度及純度進行檢測。利用TaKaRa公司提供的cDNA試劑盒將不同濃度處理及不同時間點的蘋果幼果總RNA反轉錄成單鏈cDNA，并將質量濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/mL。

1.6 基因表達分析

蘋果PAL基因引物參照Harb等[19]的引物序列，以蘋果管家基因β-actin為內參，引物序列如表1所示，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。熒光定量PCR以SYBR為熒光染料，采用20 ?L體系，包括：10.0 ?L SYBR?Premix Ex TaqTM（2×)反應液、0.4 ?L RcxDag（2×）、上下游引物各0.8 ?L、cDNA模版2 ?L、加ddH2O補至20 ?L?；靹颉㈦x心，放入PCR儀擴增。反應程序為：95 ℃變性30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個循環(huán)。反應中設置空白對照，使用雙蒸水為模版，每個樣品重復3 次。反應結束后記錄Ct值，采用2－△△Ct法[20]進行數(shù)據(jù)分析。

表1 熒光定量引物序列Table1 Sequences of primers targeting PLA and b-actin used for quantitative RT-PCR

2 結果與分析

2.1 幼果總多酚含量的變化

圖1 不同質量濃度ALA對蘋果幼果總酚含量的影響Fig.1 Impact of different concentrations of ALA on total phenol content in young apple fruit

由圖1可知，300 mg/L以內總酚含量隨ALA質量濃度升高而升高，400 mg/L時總酚含量開始有所下降，300 mg/L為最佳處理質量濃度。在不同處理時間條件下，蘋果幼果總酚含量隨著時間延長而升高，處理后12 d達到最佳。

在不同處理質量濃度不同處理時間條件下，相同處理時間內不同質量濃度ALA處理幼果后，前9 d蘋果幼果總酚含量表現(xiàn)出增長趨勢；第12天時，除300 mg/L外，其余組多酚質量濃度均開始下降；前9 d同一質量濃度不同處理時間總酚的含量也表現(xiàn)出顯著性差異，第12天時除300 mg/L外，其余組則無顯著性差異，尤其是在300 mg/L時，多酚含量增長速率最快（第6天時最高比對照高出33.33%），其含量在12 d時達到最高，比對照組高14.29%。ALA處理幼果后，蘋果幼果總酚含量總體上表現(xiàn)出增長趨勢，并在ALA質量濃度為300 mg/L處理第9天時表現(xiàn)出最佳，這與汪良駒等[21]的研究結果相同。

2.2 PAL酶活力測定

表2 不同質量濃度ALA對蘋果幼果PAL活性的影響Table2 Impact of different concentrations of ALA on PAL activity in young apple fruit

由表2可知，在不同ALA質量濃度條件下，PAL活性變化不顯著，但在300 mg/L時PAL活性表現(xiàn)出最大。幼果處理后，隨著處理時間的變化，PAL活性有顯著性變化，其中第9天酶活力最高，12d時活力開始降低。從時間上來看，處理后9 d以前PAL活性在任意質量濃度下均表現(xiàn)出升高趨勢，并在第9天各質量濃度的酶活力均達到最大，處理后第12天時酶活力均開始顯著下降；從ALA不同質量濃度上來說：300 mg/L以下酶活力均表現(xiàn)出上升趨勢，到300 mg/L時酶活力均達到最大，400 mg/L時酶活力開始降低。ALA處理后PAL活性總體上表現(xiàn)出上升的趨勢，并在300 mg/L 時表現(xiàn)出最大增長趨勢且最高（第9天）和最低（第3天）相比增幅達到92.68%，這與Xie li等[22]的研究結果相同。

2.3 PAL基因熒光定量檢測

用熒光定量方法研究了蘋果幼果體內PAL基因在不同處理時間、ALA不同質量濃度條件下表達量的變化。

由圖2可知，ALA質量濃度在300 mg/L以前，PAL基因表達變化不大；質量濃度為300 mg/L時PAL基因表現(xiàn)出最大表達量；400 mg/L時PAL基因表達量開始有所下降，但總體上表現(xiàn)為上調趨勢。在不同處理時間條件下，PAL基因表達量在處理后3～6 d期間表達量變化顯著，6～9 d變化不大，第9天時表達量最高，12 d時表達量開始降低。在不同處理質量濃度不同處理時間條件下，不同質量濃度處理9 d以前，PAL基因相對表達量均有所上升；而在第12 天時，表達量又相對下降。300 mg/L和400 mg/L處理時PAL基因表達量波動較大，特別是300 mg/L處理后第9天與第12天相比，該基因上調表達是對照的2.64倍。因此，ALA處理蘋果幼果的最佳質量濃度為300 mg/L，最佳采集幼果時間為噴灑后9 d。

圖2 各處理PAL基因表達變化量Fig.2 Impact of different concentrations of ALA on PAL gene expression in young apple fruit

3 結論與討論

不同質量濃度ALA處理幼果后，蘋果幼果體內多酚含量、PAL活性及其基因表達量均變化顯著，且呈現(xiàn)出類似的規(guī)律，即質量濃度從100～300 mg/L期間各項指標均明顯遞增，400 mg/L時開始出現(xiàn)下降趨勢。蘋果幼果多酚總體上表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，并在300 mg/L處理組第9天達到最大。不同質量濃度ALA對幼果的各項指標作用表現(xiàn)出先增后減的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象可再次證明ALA在低質量濃度下能夠促進植物代謝，高質量濃度會抑制植物代謝[23]。同一質量濃度不同時間內ALA處理幼果后，幼果體內多酚、PAL活性及其基因表達量在3～9d內遞增；第12天時PAL酶活力及其基因表達量與第9天相比時均表現(xiàn)出大幅度下降，而多酚含量變化不大，這是由于幼果體內多酚積累，但其遞增速率明顯下降。上述現(xiàn)象可能是因為ALA被完全吸收或損耗，不能持續(xù)刺激苯丙烷代謝系統(tǒng)。這一現(xiàn)象說明ALA的最佳效果期為處理后6～9 d。因此建議在現(xiàn)實生產中，盡量在疏果期前6～9d，選用300 mg/L的ALA處理幼果，才能達到疏果中多酚的最大含量。

另外，隨著ALA處理質量濃度的增加，幼果多酚的變化規(guī)律、PAL酶活性變化規(guī)律和PAL基因表達變化規(guī)律三者相吻合這一現(xiàn)象，也與前人的研究規(guī)律相同[3-4,19]，并再次驗證了“基因控制酶的合成，酶控制產物的合成”這一生物學規(guī)律。ALA刺激了蘋果體內苯丙烷代謝途徑，增加關鍵酶PAL的基因表達量，進而提高PAL酶活性，調控酚類物質的代謝，促進多酚物質的生物合成[24]。

ALA的處理質量濃度在300 mg/L以內，隨著質量濃度提高，PAL酶活性與多酚含量、相對基因表達量均升高，到400 mg/L時各項指標均表現(xiàn)出下降趨勢；ALA處理后3 項指標明顯提高，并在處理后第9天達到最高值，12 d開始下降。在現(xiàn)實生產中，為提高蘋果幼果中多酚的提取率，盡量在疏果期前6～9 d，選用300 mg/L的ALA處理幼果，才能達到疏果中多酚的最大含量，實現(xiàn)利用蘋果疏果提取多酚的最佳效果。

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Effect of 5-Aminolevulinic Acid on Polyphenol Content, PAL Activity and PAL Gene Expression in Young Apple Fruits

CHEN Lei, GUO Yu-rong, LIU Yong-feng*, MI Rui-fang, DOU Jiao
(College of Food Engineering and Nutritional Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

The purpose of this study was to find out the effect of 5-aminolevulinic acid (ALA) application on phenolic substances and phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity and PAL gene expression in young apple fruits. Apple fruits were treated with various concentrations of ALA before thinning, and then over a subsequent period of 12 days, total phenolic contents and PAL activity were measured by UV spectrophotometry and the expression of PAL gene by fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The experiment results indicated that as the ALA concentration increased up to 300 mg/L, the PAL activity, total phenolic content and PAL gene expression levels all showed an increasing trend, while the opposite pattern was observed for these three parameters when the ALA concentration was further raised to 400 mg/L. At identical ALA concentrations, all these parameters became significantly higher with prolonged treatment time, reaching the maximum levels on the 9thday, and began to fall on the 12thday. Thus, it can be concluded that treatment of young apple fruits with ALA at concentrations around 300 mg/L may result in a variety of desired physiological changes, such as markedly increasing phenolic substances and improving the activity level and gene expression of PAL.

young apple fruits; polyphenols; phenylalanine ammonia lyase; gene expression

S131.1

A

1002-6630（2014）11-0135-04

10.7506/spkx1002-6630-201411027

2013-07-11

國家現(xiàn)代農業(yè)（蘋果）產業(yè)技術體系建設專項（CARS-28蘋果產業(yè)體系）

陳磊（1988—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術與食品貯藏。E-mail：chen122148@163.com

*通信作者：劉永峰（1981—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術及營養(yǎng)學。E-mail：yongfen200@126.com