草魚皮膠原的體外自組裝動力學研究

趙 燕，魯 亮，楊 玲，鄧明霞，楊 歡，汪海波*

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

草魚皮膠原的體外自組裝動力學研究

趙 燕，魯 亮，楊 玲，鄧明霞，楊 歡，汪海波*

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

體外自組裝是天然膠原的重要分子行為特征之一，并對膠原基產(chǎn)品性能產(chǎn)生顯著影響。以草魚皮酶溶性膠原蛋白為研究對象，重點開展膠原體外自組裝動力學行為、影響因素、組裝纖維的微觀結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性能研究。濁度實驗和自組裝程度分析的結(jié)果表明，草魚皮膠原蛋白具備體外自組裝能力，其自組裝進程受膠原質(zhì)量濃度、pH值、離子強度、溫度等因素的影響。在pH 7～8、膠原質(zhì)量濃度3～5 mg/mL、體系溫度25～30 ℃以及NaCl濃度0～200 mmol/L 條件下膠原自組裝進程較快、自組裝程度較高；組裝動力學分析的結(jié)果表明，在較高的離子強度（NaCl濃度300 mmol/L）和較低的組裝溫度（20 ℃）時，膠原組裝進程表現(xiàn)為：成核、組裝和平衡3 個階段，而在較高組裝溫度（25～30 ℃）和較低離子強度時（NaCl濃度0～200 mmol/L），膠原組裝進程表現(xiàn)為：快速組裝段、低速組裝段和平衡段；膠原纖維形態(tài)學觀察結(jié)果表明，草魚皮膠原組裝纖維具有典型的D周期特征但D周期長度值（64.6 nm）小于哺乳動物膠原纖維（約67 nm）；示差掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析結(jié)果表明，經(jīng)纖維重組后，草魚皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定性得到明顯提升。

淡水魚；膠原蛋白；自組裝；動力學

膠原蛋白（collagen）是多細胞生物中含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)種類之一。在生物體內(nèi)，膠原蛋白與聚多糖等成分一起形成精密有序的細胞間網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)——細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），對機體細胞的發(fā)育、遷移以及機體組織的形成和功能發(fā)揮等均產(chǎn)生重要作用。目前已知的膠原蛋白種類超過27 種，分別被命名為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等[1]。經(jīng)過數(shù)十年的研究歷程，現(xiàn)在已基本明確了膠原的體內(nèi)生物合成路徑、分子結(jié)構(gòu)等基礎性問題。與此同時，天然膠原（特別是Ⅰ型膠原）在食品添加劑、生物醫(yī)學材料、醫(yī)學組織工程等領域也得到了越來越廣泛的應用。與傳統(tǒng)來源的哺乳動物膠原相比，魚源膠原在來源的廣泛性、生物安全性和產(chǎn)品成本等方面均具有更大的優(yōu)勢。中國是世界漁業(yè)大國，魚深加工過程中產(chǎn)生的大量廢棄物中均富含膠原蛋白，這為魚源膠原的開發(fā)與利用提供了充足的資源供給。因此，圍繞魚源膠原蛋白的性能研究及其在生物醫(yī)學材料領域中的潛在應用備受矚目[2-4]。但是，與哺乳動物膠原相比，魚膠原在熱穩(wěn)定性、耐酶降解性、生物力學性能等方面亦存在明顯不足。如何利用現(xiàn)代技術(shù)手段改善膠原性能以滿足應用需要已成為魚源膠原在生物醫(yī)學材料領域中應用的關(guān)鍵問題。

圖1 天然膠原分子自組裝示意圖[[55]]Fig.1 Diagram of natural collagen self-assembly[[55]]

自組裝（self-assemble）是天然膠原的重要分子行為特征，即具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原分子單體可以通過分子間的有序排列，形成具有交錯條紋結(jié)構(gòu)（D周期）的膠原纖維（圖1）[5]。研究發(fā)現(xiàn)，生物體內(nèi)以自組裝模式形成的膠原纖維在熱穩(wěn)定性、耐酶降解性和生物力學性能等方面均顯著優(yōu)于膠原單體分子的體外性能表現(xiàn)[6-7]。該結(jié)果提示，自組裝行為對膠原生物學性能的改善有促進作用。正是基于這一認識，天然膠原生物體內(nèi)、體外自組裝成纖維動力學過程、纖維構(gòu)造、分子學機制以及自組裝行為在生物材料構(gòu)建中的應用等研究得以深入開展。其中，組裝動力學是指導和優(yōu)化組裝條件的理論基礎。圍繞哺乳動物膠原的組裝動力學研究已深入開展，并建立了相對成熟的研究方法和理論。但是，針對魚源膠原體外自組裝的相關(guān)研究尚鮮有報道。在基于魚源膠原生物材料的開發(fā)中，大部分學者直接應用哺乳動物膠原組裝動力學的相關(guān)研究成果和結(jié)論，而忽視了魚膠原與哺乳動物膠原在氨基酸組成、分子行為等方面存在的較大差異[8-9]。因此針對魚源膠原開展組裝動力學相關(guān)研究顯得尤為迫切和必要。有鑒于此，本研究以草魚皮酶溶性膠原為對象，重點開展草魚皮膠原蛋白在不同條件下的體外自組裝動力學分析，為自組裝技術(shù)在魚源膠原性能改進中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

[10]方法，以含2%胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸為溶劑從新鮮草魚魚皮中提取酶溶性膠原蛋白，提取液經(jīng)鹽析、透析純化后冷凍干燥得到膠原蛋白樣品。該膠原蛋白經(jīng)丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）分析、紅外光譜分析和差示量熱掃描（differential scanning calorimetry，DSC）分析，證實為具有完整三螺旋分子結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原。NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaCl、鹽酸、醋酸、戊二醛（體積分數(shù)25%）、醋酸異戊酯、磷鎢酸等均為國產(chǎn)分析純；羥基脯氨酸標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

WFZUV-2000紫外光分光光度計 尤尼柯（中國）上海儀器有限公司；DSC-Q2000差示掃描量熱儀 美國TA公司；S-3000N掃描電鏡 日本Hitachi公司；Tecnai G2透射電鏡 荷蘭FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原體外自組裝動力學實驗[11]

草魚皮膠原蛋白用0.5 mol/L的醋酸充分溶解后置于透析袋中，4 ℃條件下透析，透析外液為設定pH值和離子強度的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。透析至平衡后，取出膠原溶液，低溫離心脫氣（20 000 r/min，10 min）。取3 mL離心后的膠原溶液置于比色池中，采用帶溫控附件的WFZUV-2000紫外光分光光度計于設定溫度條件下實時測定膠原溶液310 nm處的動態(tài)吸光度，繪制濁度曲線。膠原組裝的基礎條件參數(shù)為：膠原質(zhì)量濃度1 mg/mL，組裝溫度30 ℃，體系NaCl含量為150 mmol/L，體系pH 7.3。在自組裝條件對膠原組裝動力學行為的影響研究中，除考察因素外，其他條件均采用基礎條件參數(shù)。

1.3.2 自組裝程度測定[12]

醋酸溶解的膠原蛋白按上述方法透析、離心脫氣處理后，置于恒溫水浴槽中，分別在設定溫度條件下啟動自組裝。組裝完畢后離心分離組裝膠原纖維（20 000 r/min離心10 min）。以L-羥脯氨酸為對照標準品，以二甲氨基苯甲醛為顯色劑采用分光光度法定量測定離心上清液中羥基脯氨酸含量，測定標準曲線為：y=0.192 93x＋0.015 61，R2=0.998 89，式中：y為羥脯氨酸含量/（mg/mL），x為測定吸光度。按式（1）計算膠原自組裝程度[13]。

式中：m1為組裝前膠原樣品中的羥脯氨酸總量/mg；m2是組裝后樣品上清液中的羥脯氨酸總量/mg。

1.3.3 膠原纖維形態(tài)學觀察

用0.5 mol/L醋酸配制2 mg/mL的膠原蛋白溶液，4 ℃條件下透析，透析外液為含150 mmoL NaCl的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）。透析至平衡后，取出膠原溶液，低溫離心脫氣（20 000 r/min，10 min），然后將樣品緩慢轉(zhuǎn)移至離心管中，于30 ℃下水浴自組裝24 h。

透射電鏡樣品的處理：組裝后的膠原溶液進行低溫離心處理（20 000 r/min，10 min），棄去上清液后用相同的PBS緩沖液清洗膠原纖維沉淀并再次離心（重復3次），最后向膠原纖維沉淀中添加3 倍體積的PBS緩沖溶液，振蕩均勻，得到膠原纖維的分散懸浮液。將該懸浮液鋪設在200 目網(wǎng)孔的銅網(wǎng)上，用1%的磷鎢酸染色（pH 7.4，1 min），再用去離子水沖洗，風干，于200 kV下進行透射電鏡觀測。以透析后但未進行自組裝處理的膠原溶液作為對照。

掃描電鏡樣品的處理：組裝后的膠原溶液進行低溫離心處理（20 000 r/min，10 min），棄去上清液后用相同的PBS緩沖液清洗膠原纖維沉淀并再次離心（重復3 次），得到的膠原纖維沉淀用含有2%戊二醛的PBS溶液固定10 h（4 ℃），固定樣品用PBS洗滌后進行梯度脫水（30%、50%、70%、90%、100%的乙醇），隨后用乙醇-醋酸異戊酯混合溶液（體積比1∶1）浸泡兩次，每次5～10 min，最后用純的醋酸異戊酯浸泡兩次，每次5～10 min。掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察前對處理好的膠原組裝纖維進行二氧化碳臨界點干燥、噴金處理。

D周期和纖維粒徑的測量與統(tǒng)計：利用Nano measurer軟件，測量透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)和SEM圖片中膠原纖維的D周期值和纖維粒徑。從5 張TEM圖片中隨機選取30 根膠原纖維，測定纖維D周期（每根膠原纖維隨機測定5 個D周期）；從5 張SEM圖中隨機選取150 根纖維，測定纖維粒徑。所有D周期和纖維粒徑測定均取平均值并計算標準偏差。

1.3.4 熱變性溫度測定[14]

按1.2.3節(jié)方法進行膠原蛋白的溶解、自組裝處理、離心分離，離心得到的膠原纖維沉淀進行冷凍干燥。以原始膠原樣品作為測定對照。DSC測定方法：準確稱取10 mg膠原蛋白凍干樣品，用0.4 mL的蒸餾水充分溶脹24 h（4 ℃）然后用差式掃描量熱儀測定樣品變性溫度。儀器采用金屬銦進行校正（銦的熔融焓為28.451 J/g，熔點為165.4 ℃），掃描溫度范圍為20～60 ℃；升溫速率2 ℃/min，樣品室氮氣流量為20 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0自帶統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算平均值和相對標準偏差，采用單因素方差分析進行多組間比較，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義差異。

2 結(jié)果與分析

圖2 不同體系pH值條件下膠原的濁度曲線Fig.2 Turbidity curve of collagen at different pH

圖3 不同質(zhì)量濃度膠原的體外自組裝濁度曲線Fig.3 Turbidity curve of collagen at different concentrations

圖4 不同溫度和NaCl含量條件下的膠原組裝濁度曲線Fig.4 Turbidity curve of collagen at different temperatures and NaCl concentrations

2.1 組裝條件對草魚皮膠原蛋白體外自組裝行為的影響濁度實驗是研究膠原體外自組裝動力學的最常見手段。在膠原的自組裝進程中，伴隨膠原單分子有序重組為膠原微纖維和膠原纖維，膠原體系的溶液濁度也隨之增加，因此可以通過實時測定組裝體系濁度值的變化來觀察膠原溶液的自組裝進程。圖2～4分別是不同組裝條件下草魚皮膠原蛋白的體外自組裝濁度曲線。由圖可知，隨著組裝時間的延長，組裝體系濁度值也隨之增加并在最后達到平衡。該結(jié)果證實，在一定條件下草魚皮膠原蛋白具備體外自組裝能力。從濁度曲線中可以看到，體系pH值、組裝溫度、膠原蛋白初始濃度以及體系中NaCl濃度等因素均對草魚皮膠原蛋白的體外自組裝行為產(chǎn)生影響。隨著體系pH值和膠原質(zhì)量濃度的提高，草魚皮膠原體外自組裝進程也隨之加快（圖2、3），說明提高體系pH值和膠原質(zhì)量濃度對膠原蛋白的體外自組裝行為有促進作用。草魚皮膠原蛋白的體外自組裝行為也受溫度和體系離子含量的強烈影響（實驗中通過控制緩沖溶液中NaCl濃度的方法調(diào)節(jié)體系離子強度）。隨著組裝溫度的提高和體系離子強度的降低，草魚皮膠原蛋白的體外自組裝進程明顯加快（圖4），而在NaCl濃度為300 mmol/L、體系溫度20 ℃的組裝條件下，草魚皮膠原溶液310 nm處吸光度恒定不變，說明在該條件下膠原的體外自組裝行為完全受到抑制（圖4a）。

2.2 自組裝程度分析

圖5 各組裝條件對草魚皮膠原蛋白體外組裝程度的影響Fig.5 Effect of self-assembly conditions on the degree of collagen self-assembly

由圖5可知，隨著組裝時間的延長，膠原樣品的自組裝程度逐漸增加（圖5a），組裝12 h和24 h時膠原樣品的自組裝程度明顯高于組裝3 h和6 h（P＜0.05）；組裝體系pH值、膠原質(zhì)量濃度、組裝溫度以及體系離子強度對草魚皮膠原體外自組裝程度的影響趨勢與濁度曲線的實驗結(jié)果一致（圖5b～5e），即隨著膠原質(zhì)量濃度、體系溫度和體系pH值的增加，膠原自組裝程度明顯增加，而提高體系離子強度則顯著降低膠原的自組裝程度（P＜0.05）。

2.3 自組裝動力學分析

膠原蛋白的體外自組裝行為可以用一級速率方程描述[15]，即：

式中：Ae為組裝平衡階段時體系310 nm波長處的吸光度；At是t時間點時體系310 nm波長處的吸光度；k為組裝速率常數(shù)。在組裝初始階段，t=0，At= A0，因此c =－ln（Ae－A0），其中A0為組裝初始時體系310 nm波長處的吸光度，由此式（2）可轉(zhuǎn)換為：

將ln（（Ae－A0）/（Ae－At））對組裝時間t作圖，采用最小二乘法擬合直線后即可通過直線斜率得到組裝速率常數(shù)k。

表1 草魚皮膠原蛋白體外自組裝動力學參數(shù)Table1 Assembling kinetic parameters of grass carp skin collagen

由圖6和表1可知，在不同的組裝時間段，草魚皮膠原蛋白展現(xiàn)出不同的組裝速度特征。根據(jù)膠原組裝速度的不同可以將膠原自組裝過程劃分為3 個階段。其中，組裝第三階段均為組裝平衡階段，表現(xiàn)為組裝速率常數(shù)k為0或接近0；第一和第二組裝階段為組裝段，但表現(xiàn)為不同的組裝速度（k1和k2）。根據(jù)兩個組裝段擬合直線的交匯點可以得到兩階段的轉(zhuǎn)變時間點tc。當膠原質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，不同pH值條件下草魚皮膠原蛋白的自組裝行為均表現(xiàn)為第一組裝段組裝速度大于第二組裝段組裝速度（k1＞k2），且隨著體系pH值的增加，兩個組裝階段轉(zhuǎn)變時間點也隨之提前（表1）；膠原初始濃度的改變對膠原自組裝速度變化有顯著影響。隨著膠原質(zhì)量濃度的增加，組裝第一階段速率常數(shù)迅速增加（k1＞k2）且兩階段轉(zhuǎn)變時間點快速下降。當膠原質(zhì)量濃度達到5 mg/mL時，整個膠原組裝進程僅表現(xiàn)為兩個速率階段（組裝段、平衡段）（圖6b）；草魚皮膠原蛋白在不同的體系離子強度和組裝溫度條件下展現(xiàn)出不同的自組裝速度行為。在較低的離子強度（NaCl濃度100、200 mmol/L）和較高的組裝溫度（25 ℃和30 ℃）時，膠原組裝速率行為表現(xiàn)為第一組裝段組裝速度大于第二組裝段組裝速度（k1＞k2），但是在較高的離子強度（NaCl濃度300 mmol/L）和較低的組裝溫度（20 ℃）時，膠原組裝速率行為則完全相反（k1＜k2）。

2.4 組裝膠原纖維的形態(tài)學觀察

圖7 自組裝膠原纖維的形態(tài)學觀察Fig.7 Fiber morphology images of self-assembled collagen

由圖7可知，自組裝后草魚皮膠原蛋白展現(xiàn)為典型的纖維結(jié)構(gòu)且具有組裝膠原纖維的交錯條紋特征，其D周期值為（64.6±1.5）nm、纖維平均粒徑為（123.4±32.5）nm，而未組裝草魚皮膠原主要表現(xiàn)為單體分子或數(shù)個分子的低聚體形式，其粒徑范圍為3～22nm且不具備D周期特征。

2.5 膠原蛋白熱穩(wěn)定性分析

圖8 草魚皮膠原蛋白的DSC測定圖譜Fig.8 DSC curve of grass carp skin collagen

由圖8可知，在溫度掃描模式下，草魚皮膠原樣品的DSC圖譜中出現(xiàn)一個明顯的吸熱峰，歸屬于膠原分子三螺旋結(jié)構(gòu)解離的吸熱行為，其峰值溫度定義為膠原的熱變性溫度Td。對照膠原樣品的Td為（37.6±0.3）℃，而自組裝后膠原樣品展現(xiàn)出兩個并肩熱變性峰，其中Td1=（38.2±0.5）℃，Td2=（44.2±0.3）℃，該結(jié)果提示自組裝后草魚皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定性得到了顯著提升。

3 討 論

草魚皮膠原體外自組裝的濁度實驗結(jié)果表明，體系pH值、離子強度和膠原質(zhì)量濃度直接影響蛋白分子的有序聚集行為。在弱酸性條件下（pH 5.6）和較高離子強度條件下，膠原分子上帶有的同種電荷以及外來離子電荷均會對膠原分子聚集產(chǎn)生抑制作用；高質(zhì)量濃度膠原溶液（5 mg/mL）與較低質(zhì)量濃度膠原溶液（1 mg/mL和3 mg/mL）表現(xiàn)出不同的自組裝動力學行為，不僅組裝平衡時間大幅縮短而且組裝速度變化也由三段式演變?yōu)閮啥问?。但是，這種質(zhì)量濃度改變導致膠原組裝行為的變化是否會在重組膠原纖維形態(tài)上有所反映則尚需進一步的實驗驗證。草魚皮膠原組裝速度和自組裝程度均隨體系溫度的增加而增加，說明膠原自組裝是吸熱過程，因為在分子有序聚集過程中需要替換親水性氨基酸殘基上的結(jié)合水而產(chǎn)生能量消耗。

天然膠原自組裝進程可以劃分為3 個階段，即成核段、組裝段和平衡段[16]。其中“成核段”是數(shù)個分子聚集成膠原微纖維核，由于尺度較小，因此在濁度實驗中表現(xiàn)為吸光度的緩慢上升或維持不變；而“組裝段”是膠原分子圍繞微纖維核進一步聚集的過程，表現(xiàn)為溶液吸光度的快速上升。在本次實驗中，草魚皮膠原在多數(shù)實驗條件下（20 ℃和NaCl濃度300 mmol/L條件除外）表現(xiàn)為不同于哺乳動物膠原的自組裝行為，即沒有明顯的“成核段”而是以“快速組裝段”、 “低速組裝段”和“平衡段”為典型特征。由于魚類最適生存溫度一般低于30 ℃，因此魚類膠原熱變性溫度和最適自組裝溫度均低于哺乳動物膠原，即使在較低溫度條件下魚類膠原分子也可能產(chǎn)生分子間的聚集行為。由此，草魚皮膠原自組裝“成核段”的消失可能是因為在膠原溶液的透析階段（4 ℃）就已經(jīng)完成了成核過程。針對透析但未自組裝膠原的粒徑分析可以發(fā)現(xiàn)其粒徑分布在3～22 nm范圍（圖7a），符合膠原微纖維的粒徑特征。

草魚皮膠原自組裝纖維形態(tài)學觀察的結(jié)果證實魚類膠原的體外自組裝也是一種分子間有序排列的過程，即表現(xiàn)為錯列分布的橫紋D周期。哺乳動物膠原纖維D周期值約為67 nm[17]，但是我們測定的草魚皮膠原纖維D周期值為（64.6±1.5）nm。為了消除觀察設備的影響，以豬皮膠原為對照，在相同條件下觀察豬皮自組裝膠原纖維的D周期值，結(jié)果為（67.2±1.8）nm，說明草魚皮膠原組裝纖維結(jié)構(gòu)與哺乳動物膠原存在差異性。

自組裝前后膠原熱變性溫度的測定結(jié)果表明，經(jīng)自組裝處理后草魚皮膠原出現(xiàn)兩個并肩熱變性峰。其中Td1溫度與對照Td基本一致，而Td2溫度則明顯提升（P＜0.05）。膠原分子熱變性過程的實質(zhì)是膠原三肽鏈的解離。其中，水分子發(fā)揮重要作用。只有當水分子滲透進入三肽鏈內(nèi)部，這種解離過程才能實現(xiàn)[18]。膠原自組裝的纖維化行為顯然增加了水分子的滲入難度，從而提升了膠原分子的熱變性溫度。自組裝膠原中同時存在Td1和Td2變性溫度，說明在自組裝膠原產(chǎn)品中仍有部分未纖維化的膠原單體或低聚體分子存在。

4 結(jié) 論

與哺乳動物膠原一樣，草魚皮膠原蛋白具備體外自組裝能力，但是其自組裝行為受膠原質(zhì)量濃度、pH值、離子強度、溫度等因素的影響。草魚皮膠原蛋白可以通過自組裝形成具有D周期特征結(jié)構(gòu)的膠原纖維，但是其D周期長度值略低于哺乳動物膠原。經(jīng)纖維重組后，草魚皮膠原蛋白的熱穩(wěn)定性得到明顯提升。

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Self-Assembly Kinetics of Collagen from Grass Carp Skin

ZHAO Yan, LU Liang, YANG Ling, DENG Ming-xia, YANG Huan, WANG Hai-bo*
(Collage of Food Science and Technology, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

In this study, the kinetic behavior and influential factors of self-assembly, fiber morphology and thermal stability of pepsin soluble collagen from grass carp skin were explored. The turbidity and self-assembly degree indicated that grass carp skin collagen had self-assembling ability although it was influenced by collagen concentration, pH, ionic strength and temperature. Under the conditions of 7–8, 3–5 mg/mL, 25–30 ℃ and 0–200 mmol/L for pH, collagen concentration, culture temperature and NaCl concentration, respectively the self-assembling process progressed faster and finally reached a higher level. The kinetic analysis suggested that the whole assembly react ion could be divided into nucleating, fibrillogenesis and plate phases at higher ionic strength and lower temperature, but divided into rapid assembly, slow assembly, and plate phases when the assembling conditions were changed to lower ionic strength and higher temperature. Morphological observations indicated that grass carp skin collagen could be self-assembled into fibrils with characteristic D-periodicity in vitro, but the length of D-periodicity (64.6 nm) was smaller than that of the mammalian counterpart (approximately 67 nm). The results of DSC analysis showed that the thermal stability of grass carp skin collagen was obviously improved after self-assembly.

fresh water fish; collagen; self-assembly; kinetics

S 943

A

1002-6630（2014）11-0021-06

10.7506/spkx1002-6630-201411005

2013-11-14

國家自然科學基金面上項目（21376183）；武漢市科技局科技攻關(guān)計劃項目（200920137006）；武漢市農(nóng)副資源循環(huán)利用與新產(chǎn)品開發(fā)工程技術(shù)中心資助項目（201120637175）；湖北省自然科學基金重點項目（2009CDA117）；武漢市科技局應用基礎研究項目（2013020501010177）；湖北省高等學校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊計劃項目（T201208）

趙燕（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：wanghaibo@whpu.edu.cn

*通信作者：汪海波（1971—），男，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：wanghaibo@whpu.edu.cn