氣相色譜法測定奶茶中的反式脂肪酸

周紅霞 華 春 阮 鳴 賈政華 沈 娟

(南京曉莊學院生物化工與環(huán)境工程學院1 ，南京 211171)(江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心2，南京 210036)

反式脂肪酸(Trans Fatty Acids，TFA)又名氫化脂肪酸，是所有含有反式雙鍵的不飽和脂肪酸的總稱。大量研究證明， 反式脂肪酸的攝入會對人體健康產(chǎn)生不利影響，如影響必需脂肪酸的消化吸收、 導致心血管疾病的發(fā)生、抑制嬰幼兒生長發(fā)育等[1-3]，還會導致癌癥、肝功能失調(diào)、肥胖，還會造成婦女不育[4-6]。國際上極為重視食品中反式脂肪酸的檢測與標識，反式脂肪酸的研究已受到國外學者的高度重視。美國早在1993年已經(jīng)拉開了對反式脂肪酸的研究序幕，現(xiàn)今丹麥、法國等已對反式脂肪酸限量進行了立法[3]。在中國，反式脂肪酸并未引起人們的廣泛重視。反式脂肪酸的加工食品有很多，油炸食品，如薯條、油條、油酥餅；咖啡伴侶或速溶咖啡；薯條、薯片等。國內(nèi)關(guān)于反式脂肪酸的研究數(shù)據(jù)并不多[7-9]，尤其是對奶茶TFA的檢測。曹君等[4]用氣相色譜法測定了目前市面上常見奶茶品種中脂肪酸組成，并對其中的危害因子TFA 含量進行分析。目前，食品中反式脂肪酸的檢測方法主要有：氣相色譜法(GC)、紅外光譜法(IR)、薄層色譜法(TLC)等，其中研究較多的是氣相色譜法。已有資料表明，不同色譜條件對反式脂肪酸的分離效果不同，關(guān)鍵問題是不能完全分離順/ 反式烯酸異構(gòu)體[10-17]。本研究對奶茶中的反式脂肪酸經(jīng)三氟化硼甲醇甲酯化處理后，用氣相色譜法測定了其中41種混合脂肪酸，旨在將41種混合脂肪酸甲酯得到相對滿意的分離，尤其是反式脂肪酸與其他組分分離，并能準確對常見反式脂肪酸進行定性定量，以滿足日常安全檢測的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種奶茶：市售; 正庚烷(色譜純)、三氟化硼甲醇、乙醇、焦性沒食子酸、乙醚、無水硫酸鎂、氫氧化鉀、甲醇均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；反式脂肪酸甲酯標準品溶液，如反十四碳一烯酸甲酯(5tC14∶1)、反十六碳一烯酸甲酯(7tC16∶1)、反油酸甲酯(9tC18∶1)、反異油酸甲酯(10tC18∶1)、反異油酸甲酯異構(gòu)體(11tC18∶1)、反亞油酸甲酯(6tC18∶2)、反二十碳一烯酸甲酯(9tC20∶1)、反二十二碳一烯酸甲酯(9tC22∶1)：美國 NuChek-Prep公司。

1.2 儀器與設備

VARIAN CP-380氣相色譜儀：美國VARIAN公司；WH-2微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司； HP-88(100 m×0.25 mm×0.20 μm)毛細管色譜柱：美國 Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取[6]

參照國標GB/T 22223—2008方法，將其中脂肪的水解由堿水解改為酸水解法。稱取1 g樣品移入到250 mL燒瓶中，加入約100 mg焦性沒食子酸和2 mL無水乙醇，混勻后加入10 mL鹽酸，混勻。將燒瓶放入70～80 ℃水浴40 min后冷卻至室溫。加入10 mL 95%乙醇，混勻。將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入50 mL乙醚加蓋，振搖5 min，靜置10 min，將乙醚層提取液收集到250 mL燒瓶中，以上步驟重復3次。揮發(fā)溶劑，殘留物即為脂肪提取物。

1.3.2 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化[6]

在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉溶液8 mL， 80 ℃水浴上回流至油滴消失，加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，80 ℃水浴回流2 min后冷卻燒瓶至室溫，加入10 mL正庚烷，振搖2 min，加入飽和食鹽水溶液，靜置分層，吸取上層正庚烷提取液5 mL至試管中，加入約3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層溶液到進樣瓶中待測定。

1.4 色譜分離條件[4]

色譜儀：VARIAN CP-3800；檢測器：氫火焰離子化檢測器FID；色譜柱：HP-88 毛細管柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；色譜條件：氣化室溫度：250 ℃；柱溫：150 ℃(10 min)-5 ℃/min-230 ℃(40 min)；檢測器溫度：260 ℃；氮氣：1 mL/min；氫氣：30 mL/min，空氣： 300 mL/min。

1.5 色譜測定[2]

對照品檢測：取1 μL脂肪酸甲酯混合標準溶液注入氣相色譜儀，在上述色譜條件下測定標準溶液的峰面積，得到每個脂肪酸甲酯的相對保留時間和氣相色譜圖，計算出分離度。

樣品檢測：取1 μL酯化好的樣品溶液注入氣相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的峰面積。經(jīng)過與標準溶液譜圖比較峰面積得到樣品中脂肪酸甲酯的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離情況

食品中常見的反式脂肪酸主要包括5tC14∶1、7tC16∶1、9tC18∶1、6tC18∶2、9tC20∶1、9tC22∶1 6類，但總脂肪酸成分很復雜，包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其中, 不飽和脂肪酸又分為順式不飽和脂肪酸和反式不飽和脂肪酸[4]。正是由于反式脂肪酸的種類及其空間異構(gòu)體繁多，對它們各組分的分離及官能團定位等方面存在技術(shù)上的困難，反式脂肪酸含量的測定難點在于能將順、反異構(gòu)體分離。

取1 μL脂肪酸甲酯混合儲備液標準溶液注入氣相色譜儀。色譜分離情況如圖1，色譜系統(tǒng)評價見表1。

圖1 脂肪酸甲酯分離情況

表1 多組分脂肪酸甲酯色譜分離保留時間與分離度

序號名稱保留時間/min理論塔板數(shù)/m分離度1C4∶019．535515105302C6∶020．30926631837．13C8∶021．614352463110．04C10∶023．674470881617．05C11∶025．006536066511．06C12∶026．517605895313．07C13∶028．205658387515．08C14∶030．011716543815．095tC14∶130．99174937568．410C14∶131．54274350974．711C15∶031．88282069382．912C15∶133．478810446213．013C16∶033．79984569362．7147tC16∶134．70287486617．515C16∶135．74085104123．916C17∶037．19792801294．517C17∶137．738917487011．018C18∶037．73894014234．3199tC18∶138．53175964815．82010tC18∶138．62862872980．62111tC18∶138．73465765600．722C18∶139．10194101082．6236tC18∶240．00794807756．824C18∶241．14394987408．425C20∶041．99996979446．226C18∶342．74388891835．2279tC20∶143．03298973112．028C20∶143．6090N/A29C18∶343．6723623156N/A30C21∶044．36297988733．631C20∶246．0888918280N/A32C22∶047．00189858655．733C20∶348．10483580986．6349tC22∶148．31689856561．335C22∶149．05494541504．536C20∶349．25781872171．237C20∶449．74177457302．738C23∶049．95086941161．239C22∶252．254816810712．040C24∶053．37378714155．841C24∶156．118749073712．0

本試驗采用100 m長HP-88毛細管石英柱色譜柱進行多組分脂肪酸快速分離，由圖1、表1中可以看出41種混合脂肪酸56 min內(nèi)得到完全分離。其中， 9tC18∶1、6tC18∶2、出峰時間分別為38.531 min和40.007 min，各組分理論塔板數(shù)均大于40 000，分離度基本大于1.5，完全可以滿足食品中反式脂肪酸的檢測要求。另外，從圖1中還可以看出在本色譜條件下各脂肪酸甲酯出峰順序有一定的規(guī)律：飽和脂肪酸甲酯出峰順序與碳鏈長度有關(guān)系，碳鏈越長出峰越遲，如C12∶0先于C15∶0；相同碳鏈脂肪酸甲酯不飽和度越大，保留時間越長，C18∶0保留時間短于6tC18:2；而順反異構(gòu)的不飽和脂肪酸甲酯是反式先出峰，順式后出峰，如9tC18∶1先于C18∶1出峰[5-6]；同一異構(gòu)體的不飽和脂肪酸，稀鍵所在碳原子數(shù)序號大的色譜峰居于序數(shù)小的之前[2]，如9tC18∶1保留時間短于10tC18∶1，10tC18∶1保留時間短于11tC18∶1；但這幾種異構(gòu)體保留時間相差很小(表1)，分離度不好，這是因為他們的結(jié)構(gòu)非常相似，僅不飽和鍵的位置不同。

2.2 方法線性關(guān)系和精密度

分別配制5、10、20、50、100 μg/mL系列標準溶液溶液，進樣1 μL，記錄色譜圖，并以濃度對峰面積計算各組分回歸方程，對20 μg/mL樣品，連續(xù)進樣5次，計算RSD，結(jié)果見表2。 由表2可看出，在質(zhì)量濃度為5～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，各脂肪酸RSD小于3.1%，符合外標法要求，精密度較好。

表2 幾種反式脂肪酸的標準曲線

2.3 最小檢測限

以基線信噪比3∶1所對應的濃度為方法的最小檢測限。將10 μg/mL對照品溶液稀釋5倍，即含5tC14∶1、7tC16∶1等皆為2 μg/mL的溶液進樣測得信噪比為3∶1，則各組分的最小檢測質(zhì)量濃度為2 μg/mL，滿足檢測要求，結(jié)果見表2。

2.4 回收率試驗

向3份原味奶茶樣品中分別加入不同量的5tC14∶1、9tC18∶1 標準品，檢測結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果

2.5 樣品檢測

由于食品中脂肪酸以脂肪酸三酰甘油形態(tài)存在，在計算反式脂肪酸時需將脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅崛８视偷男问?，但是當碳?shù)≥8時，脂肪酸甲酯和脂肪酸三酰甘油的轉(zhuǎn)換系數(shù)Tri/FAME>0.99[8]，因此可用反式脂肪酸甲酯的含量代替反式脂肪酸的含量。將所采集的樣品按1.3.1，1.3.2進行處理，進樣1 μL，記錄相應的色譜圖。分析其中反式脂肪酸，圖2為奶茶樣品色譜情況。

圖2 奶茶樣品色譜情況

由圖2看出，本試驗條件下，在41 min內(nèi)基本出峰， 經(jīng)過計算，反式脂肪酸含量見表4，可見奶茶中均含有反式脂肪酸，且主要以9tC18∶1為主。

表4 奶茶中反式脂肪酸含量

3 結(jié)論

3.1 本研究采用HP-88毛細管石英柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)，實現(xiàn)了41種脂肪酸甲酯的有效分離，具有成本低、效率高、快速準確的優(yōu)點。本方法適用于奶茶類飲品營養(yǎng)標簽的快速測定。

3.2 在此試驗條件下，8種反式脂肪酸的線性范圍均為5～100 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，檢出限為2 μg/mL，加標回收率在86.9%～91.0%之間，相對標準偏差小于3.1%。

3.3 對產(chǎn)檢市售奶茶檢測發(fā)現(xiàn)，奶茶中基本都含有反式脂肪酸，尤以紅棗味蒙古奶茶和經(jīng)典奶茶為最，這對市民在購買奶茶類飲品的時候有一定的指導意義。

3.4 本方法將國標法中脂肪的水解由堿水解改為酸水解法，有效破壞了乳制品中的脂肪球，提高了脂肪提取率。

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