不同溶劑及輔助方法對花生殼提取物中 木犀草素含量及抗菌作用的影響

周建新 林 姣 包月紅 吳萌萌

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)糧食儲運(yùn)國家工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210046)

花生殼屬于農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物中數(shù)量十分可觀的生物質(zhì)資源，我國每年大約有200多萬t的花生殼[1]，如何更好地使花生殼中的各種有效成分得到合理利用，提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，具有十分重要的社會意義[2]。木犀草素作為花生殼中最主要的黃酮類化合物，已被研究人員通過動物和臨床試驗(yàn)證明其具有抗氧化性抗炎癥、抗病毒性、降血脂和膽固醇、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[3-9]。體外試驗(yàn)也證明了花生殼提取物具有抗氧化與抗菌作用，可作為食品天然抗氧化劑和防腐劑開發(fā)，其中起主要作用的就是木犀草素[10-12]。目前，從花生殼中提取黃酮類化合物或木犀草素主要有有機(jī)溶劑法[13]，輔助方法主要有超聲波法[14]和微波法[15-16]等，這些研究表明溶劑種類與濃度、料液比、提取溫度與時(shí)間及輔助方法等影響花生殼提取物中黃酮類化合物或木犀草素的含量，由于花生殼提取物中的抗菌物質(zhì)主要是木犀草素，所以這些因素必然也會影響其抗菌活性[17]。因此，研究不同溶劑及輔助方法對花生殼中木犀草素含量和抗菌作用的影響，對于進(jìn)一步開發(fā)花生殼為食品天然防腐劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生殼：江蘇南通市，手工剝殼，洗凈后50 ℃干燥箱中烘干，用粉碎機(jī)磨成粉，過50目篩后備用；實(shí)驗(yàn)菌種：金黃色葡萄球菌6538(Staphylococcusaureus6538)，江蘇省疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠，活化后配制成所需菌量的懸浮液[18]。

木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma-Alorich公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，250 g，杭州天和微生物試劑有限公司；乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯：分析純；甲醇：色譜純，均為南京化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

101-3AS型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠；FW80型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；JM-B5002型電子天平：余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；TP214型電子分析天平：丹佛儀器(北京)有限公司；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-220型恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SM-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；EX20型生物顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；WP800SL23-2型微波爐：格蘭仕微波爐電器有限公司；DZF-6090型真空干燥箱：武漢尚測試驗(yàn)設(shè)備有限公司；gilent-1260型高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同溶劑對花生殼提取物中木犀草素含量及抗菌作用的影響

稱取10.00 g花生殼粉5份，分別至250 mL錐形瓶中，各自加入150 mL的 75%甲醇、75%乙醇、75%丙酮、乙酸乙酯和水(花生殼粉g/溶劑體積mL，即料液比為1∶15)，放入50 ℃水浴鍋中磁力攪拌提取2 h。經(jīng)抽濾后濾渣重新倒入150 mL相應(yīng)提取溶劑，再提取1h，抽濾后，合并兩次濾液，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，經(jīng)蒸發(fā)濃縮后，定容至半浸膏狀態(tài)，置于50 ℃真空干燥箱中干燥，稱量，計(jì)算提取得率(提取物質(zhì)量/花生殼粉質(zhì)量×100%)，用50%乙醇定容至10 mL，此為提取物原液(原料花生殼/定容體積，1 g/mL)備用。

取一部分提取物原液經(jīng)稀釋后過0.22 μm濾膜，用HPLC檢測木犀草素含量[19]。

以金黃色葡萄球菌作為指示菌，按平板計(jì)數(shù)法分別測定提取物的抗菌作用[18]：用50%乙醇對花生殼提取原液進(jìn)行倍比稀釋，取稀釋液各5 mL，倒入100 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，25 min)；吸取金黃色葡萄球菌菌懸液(102～103個(gè)/mL)200 μL于無菌培養(yǎng)皿中，倒入相應(yīng)含提取物原液或稀釋液的培養(yǎng)基，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)(36 ℃，24 h)。計(jì)數(shù)并計(jì)算抗菌率。抗菌率=(1-加提取物菌落數(shù)/未加提取物菌落數(shù))×100%。

1.4.2 不同輔助方法對花生殼提取物中木犀草素含量及抗菌作用的影響

本試驗(yàn)采用4種方法：超聲波、微波、恒溫振蕩和水浴回流輔助提取花生殼中的木犀草素。稱取20.00 g花生殼粉，放入含200 mL 70%乙醇溶液錐形瓶中，置相應(yīng)的設(shè)備中處理，抽濾，濾渣再倒入400 mL 70%乙醇溶液進(jìn)行第二次處理，抽濾，合并兩次濾液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至半浸膏狀態(tài)后置于50 ℃真空干燥箱中干燥，稱量，計(jì)算提取得率。設(shè)置條件為超聲波(溫度50 ℃，2 h)；微波(20 s，停頓1 min，總時(shí)間5 min)；恒溫振蕩(溫度50 ℃，轉(zhuǎn)速150r/min，2 h)；水浴回流(溫度50 ℃，2 h)。上述提取物用50%乙醇定容至10 mL，得到提取液原液。

提取物原液中木犀草素含量檢測同1.4.1。

以金黃色葡萄球菌作為指示菌，按濾紙片法分別測定提取物的抗菌作用[20]：吸取200 μL菌懸液(105～106個(gè)/mL)于平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基表面，L型玻璃棒涂勻，無菌鑷子取出在花生殼提取物原液或稀釋液中浸泡3 h的濾紙片(直徑6 mm)貼在平板上，每個(gè)培養(yǎng)皿貼3片，并用50%乙醇溶液浸泡濾紙片作對照。培養(yǎng)(36 ℃、24 h)，游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑對花生殼提取物中木犀草素含量及抗菌作用的影響

2.1.1 不同溶劑對花生殼提取物中木犀草素含量的影響

不同溶劑花生殼提取物的木犀草素的含量如表1所示，從表1中可以看出，乙醇和水的提取得率最高，丙酮提取物略低，甲醇次之，乙酸乙酯最低；而提取物中木犀草素的含量測定中，丙酮提取物中最高，乙醇次之，甲醇略低于乙醇，乙酸乙酯和水的相對較低。但從提取物中木犀草素絕對量來看，丙酮>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>水，考慮到丙酮和甲醇對人體的危害性，選擇相對安全的乙醇作為花生殼中木犀草素提取溶劑比較合適。

表1 不同溶劑花生殼提取物中木犀草素的含量/%

注：提取物中木犀草素絕對量=提取得率×木犀草素含量。同列上標(biāo)字母不同者差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 不同溶劑對花生殼提取物抗菌作用的影響

金黃色葡萄球菌是食品中常見的致病菌，因此以其作為試驗(yàn)菌種進(jìn)行花生殼提取物抗菌作用具有代表性。不同溶劑提取物的原液及倍比稀釋液對實(shí)驗(yàn)菌的抗菌作用如表2所示，從表2中可以看出，在同一濃度下不同溶劑的花生殼提取液的抗菌效果不一樣。當(dāng)提取物濃度均為1 g/mL(原液)時(shí)，乙醇、甲醇及丙酮提取物的抗菌率均達(dá)到了100%，顯著高于乙酸乙酯和水提取物，這與上面檢測木犀草素絕對含量的高低相一致。同時(shí)對于同種溶劑提取物而言，隨著提取物濃度的增加，抗菌率提高，抗菌作用越顯著，如對于乙醇提取物，隨著濃度的倍比增加，抗菌率從0.25 g/mL時(shí)的 (11.5±0.4)%上升到1 g/mL時(shí)的100%。

表2 不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌率/%

注：同列上標(biāo)字母不同者差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 花生殼提取物木犀草素含量與抗菌作用的相關(guān)性

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，在同一濃度下，不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌率與提取物中木犀草素絕對含量或花生殼提取物得率之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示，在同一提取物濃度下，不同溶劑提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌率與花生殼提取物得率之間無顯著相關(guān)(P>0.5)，但與木犀草素的絕對含量呈正顯著相關(guān)(P<0.05)。

表3 不同溶劑提取物中木犀草素絕對含量及提取得率

注：*表示顯著，P<0.05；**表示極顯著，P<0.01。

2.2 不同輔助方法對花生殼提取物中木犀草素含量及抗菌作用的影響

2.2.1 不同輔助方法對花生殼提取物中木犀草素含量的影響

在對植物活性成分提取方法的研究中，選擇合適的輔助提取方法，將會使提取效果顯著提高[14-16]。4種輔助方法得到的花生殼提取物原液，木犀草素含量的測定結(jié)果如表4，表明通過不同輔助方法提取的木犀草素，微波提取得率最高為(4.6±0.6)%，顯著高于超聲波提取的(4.1±0.3)%，水浴回流提取的(3.9±0.1)%，以及振蕩提取的(3.2±0.4)%。提取物中的木犀草素含量有所不同，其中，采用水浴回流法提取得到的提取物木犀草素含量最高達(dá)(16.6±1.3)%，其次分別是恒溫振蕩法>微波法>超聲波法。而從木犀草素絕對含量看，水浴回流法>微波法>恒溫振蕩法>超聲波法。與溶劑提取法相比，輔助方法提取花生殼中木犀草素具有絕對含量高、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。

表4 不同輔助方法提取物中木犀草素的含量/%

注：同列上標(biāo)字母不同者差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 不同輔助方法對花生殼提取物抗菌作用的影響

不同輔助方法提取的花生殼提取物抗金黃色葡萄球菌的情況如表5所示，表中顯示，不同輔助提取條件下，對金黃色葡萄球菌的抗菌作用不一樣，抗菌大小依次為：水浴回流>微波>恒溫震蕩>超聲波。例如：原液時(shí)，回流提取物的抑菌圈直徑是(9.34±0.29) mm，微波提取物的為(9.20±0.41) mm，振蕩提取物(9.00±0.32) mm，超聲波提取物的抑菌圈直徑最小，為(8.03±0.23) mm。另外，抑菌圈的直徑都是隨著濾紙片所泡提取液濃度的升高而增大，且在濃度為0.25 g/mL以下，抑菌圈直徑上升較快，之后幾乎呈穩(wěn)定上升趨勢；抗菌效果與木犀草素含量一致。這說明水浴提取在這幾種方法中效果最好，可能是由于水浴溫度較高，分子運(yùn)動加快，有利于木犀草素的提取。

表5 不同輔助方法提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑/mm

注：同列上標(biāo)字母不同者差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 不同輔助方法花生殼提取物木犀草素的含量與抗菌作用的相關(guān)性

根據(jù)表5數(shù)據(jù)，在同一濃度下，不同輔助方法得到的花生殼提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈與提取物中木犀草素絕對含量或花生殼提取物得率之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表6所示。從表6中可以看出，在同一濃度下，提取物的抗菌效果與木犀草素絕對含量存在顯著的正相關(guān)性，而與提取物的得率則無相關(guān)性，說明提取物的抗菌作用(以抗菌圈直徑表示)與所提取的木犀草素量有關(guān)，木犀草素含量越高，抗菌作用越好；與提取物的得率無關(guān)，提取物得率的高低，與不同輔助方法溶解性能有關(guān)，而提取物中具有抗菌成分的高低才是影響提取物抗菌活性的關(guān)鍵，這也側(cè)面反應(yīng)了木犀草素是提取物中影響抗菌活性的一個(gè)重要的抗菌活性成分。

表6 提取物抗菌圈直徑與木犀草素絕對含量

注：*表示顯著，P<0.05；**表示極顯著，P<0.01。

3 結(jié)論

通過對花生殼提取物木犀草素含量及對金黃色葡萄球菌抗菌作用的測定，表明提取物中木犀草素的絕對含量和抗菌效果與提取溶劑和輔助方法有關(guān)。提取物中木犀草素的絕對含量和在同一濃度時(shí)抗菌效果依次是丙酮>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>水、水浴回流法>微波法>恒溫震蕩法>超聲波法；同時(shí)對于同種溶劑或輔助方法提取物而言，隨著提取物濃度的增加，抗菌作用越顯著。通過SPSS17.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，表明對金黃色葡萄球菌的抗菌作用與提取物中木犀草素的絕對含量呈正顯著相關(guān)，與花生殼提取物得率之間無顯著相關(guān)。

輔助方法有助于提高花生殼提取物木犀草素絕對含量和抗菌效果，有利于花生殼作為食品天然防腐劑的開發(fā)。

[1]石亞中，伍亞華.花生殼綜合利用研究現(xiàn)狀[J].花生學(xué)報(bào)，2008，37(2)：41-44

[2]孫豐文，張茜，李自峰. 花生殼綜合利用的研究進(jìn)展[J].山東林業(yè)科技, 2008(6)：84-88

[3]Kahiwada Y，Aoshima A，Ikesiro Y，et al. Anti-HIV benzyl isoquino line alkaloids and flavonoids from the leaves of Nelumbo nutifera，and structure-activity correlations with related alkaloids [ J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry，2005，13(2)：443-448

[4]Tewtrakul S，Miyashiro H，Nakamura N，et al. HIV-1 integrase inhibitory substances from coleus parvifolius[J]. Phytotherapy Research，2003，17(3)：232-238

[5]Kimata M，Inagaki N，Nagai K. Effect of luteolin and other flavonoids on IgE-mediated allergic reaction[J]. Planta Medica，2000(66)：25-29

[6]Kuo M Y，Liao M F， Chen F L，et al. Luteolin attenuates the pulmonary inflammatory response involves abilities of antioxidation and inhibition of MAPK and NFJB pathways in mice with endotoxin-induced acute lung injury[J].Food and Chemical Toxicology，2011(49):2660-2666

[7]Liisa T，Pia V，Elise S，et al. In vivo treatment of acute Chlamydia pneumoniae infection with the flavonoids quercetin and luteolin and an alkyl gallate，octyl gallate，in a mouse model[J]. Biochemical Pharmacology, 2005，70(8) ：1222-1230

[8]王洪燕，全康，蔣燕靈，等.木犀草素抗腫瘤細(xì)胞增殖及增敏抗腫瘤藥物作用研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，39(1)：30-36

[9]汪麗燕,韓傳環(huán),王萍.木犀草素對冠脈血流動力的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 1992，8(5)： 388-390

[10]黎碧娜，曾慶贊，陳楚光.從花生殼中提取天然抗氧化成分的研究[J].現(xiàn)代化工，1995(10)：31-33

[11]周建新，嵇美華，汪海峰，等.花生殼乙醇提取物(EEPH)抗菌性的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào), 2004，19 (1)：64-66

[12]王倩，謝明杰.木犀草素對金黃色葡萄球菌的抑菌活性及其機(jī)制[J].微生物學(xué)報(bào)，2010，50(9)：1180-1184

[13]楊穎，宋曙輝，徐桂花.木犀草素的生理功能、提取、純化及應(yīng)用的研究[J].食品工程，2010(1)：19-24

[14]喬良博，林華衛(wèi)，馬雄，等.微波輔助提取花生殼中總黃酮的工藝研究[J].四川食品與發(fā)酵,2011，47(4)：34-37

[15]肖淑娟，李紅霞，于守武. 超聲波輔助法提取花生殼中木犀草素[J]. 河北理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，30(2):96-99

[16]裘紀(jì)瑩，杜方嶺，祝清俊，等.超聲波輔助提取花生殼總黃酮工藝的優(yōu)化[J].中國食物與營養(yǎng), 2011, 17(7)：34-36

[17]許暉，孫蘭萍，張斌，等.花生殼黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊, 2008(3)：11-15

[18]周建新，姚明蘭，岳文倩，等. 蜂膠的抗菌性及其影響因素的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007,33(3)：41-43

[19]林姣.花生殼木犀草素的提取分離及抗菌作用的研究[D].南京：南京財(cái)經(jīng)大學(xué)，2013：11-17

[20]周邦靖.常用中藥的抗菌作用及其測定方法[M].重慶:科學(xué)技術(shù)出版社重慶分社,1987：152-155.