DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中脂肪酶催化合成正辛酸甲酯

杜 歡 談忠琴 宋樂(lè)蓮 韓曉祥 勵(lì)建榮

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系1，杭州 310035)(渤海大學(xué)遼寧省食品與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，錦州 121013)

正辛酸甲酯是一種具有酒、水果、甜橙香氣的無(wú)色至淺黃色澄清液體，常用于食品工業(yè)和化妝品的香料配料，此外，還用于染料、香料、醫(yī)藥的合成，也可用于酸性蛋白質(zhì)的沉淀，在蛋白純化中有較廣泛的應(yīng)用。目前工業(yè)制備辛酸甲酯的方法有很多，最主要的是用正辛酸與甲醇在硫酸催化下進(jìn)行酯化反應(yīng)，但硫酸催化時(shí)存在活性低、選擇性差、易發(fā)生副反應(yīng)、產(chǎn)物不易提純、腐蝕性強(qiáng)、污染環(huán)境嚴(yán)重等缺點(diǎn)，不符合當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展的要求[1]。采用固體酸、金屬鹽類、堿性脂肪酶等催化劑[2-10]，雖然在一定程度上解決了傳統(tǒng)催化劑存在的一些缺點(diǎn)，但它們?nèi)源嬖谙鄬?duì)活性低、表面易積碳、酸性位密度低和酸強(qiáng)度分布不均等缺陷[11]，從而限制了它們的應(yīng)用。

微乳體系是指由油、水、表面活性劑和助劑按照一定比例自發(fā)形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的、外觀透明或半透明的高度分散體系，其分散相膠束粒徑為10～100 nm，具有超低的界面張力，穩(wěn)定的熱力學(xué)特性及對(duì)難溶液體的強(qiáng)溶解性，且價(jià)格廉價(jià)，廣泛用于納米材料制備、有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、聚合反應(yīng)、酶催化、分離等領(lǐng)域[12-16]。微乳體系作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)可克服試劑不相溶性，改善反應(yīng)物局部濃度，增強(qiáng)區(qū)域選擇性，提高酶的穩(wěn)定性等，從而提高反應(yīng)速率。脂肪酶作為一種生物催化劑，在合成反應(yīng)中具有很高的區(qū)域選擇性和立體選擇性，在微乳體系中進(jìn)行脂肪酶催化反應(yīng)已有研究報(bào)道[17-20]。

在十二烷基苯磺酸(DBSA)/環(huán)己烷/水微乳體系中分別進(jìn)行了有無(wú)脂肪酶PPL催化下香料正辛酸甲酯的合成研究，同時(shí)考察微乳體系中含水量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、緩沖溶液pH值、醇酸物質(zhì)的量比、加酶量等因素對(duì)正辛酸甲酯轉(zhuǎn)化率的影響，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)正辛酸甲酯的合成反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DBSA：日本Tokyo Kasei Kogyo有限公司；豬胰脂肪酶(PPL)：Sigma-Aldrich公司；環(huán)己烷、正辛酸、甲醇、氫氧化鈉、酚酞及其他試劑：邁瑞化學(xué)試劑公司。

1.2 微乳體系的制備

將一定質(zhì)量的DBSA與環(huán)己烷混合，在磁力攪拌器上邊攪拌邊滴加去離子水，當(dāng)混合溶液變澄清時(shí)，所加水量記作第一相變點(diǎn)，繼續(xù)滴加，當(dāng)溶液變渾濁時(shí)，所加水量記作第二相變點(diǎn)，中間一段澄清的溶液稱為微乳液。改變DBSA與環(huán)己烷的比例，重復(fù)上述操作，測(cè)得一系列相變點(diǎn)數(shù)據(jù)，根據(jù)相變點(diǎn)處DBSA、環(huán)己烷、水3個(gè)組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，用Origin 8.0繪制三相圖，確定微乳區(qū)與非微乳區(qū)。

根據(jù)所繪制的三相圖，在微乳區(qū)中任取幾個(gè)特殊點(diǎn)，將DBSA、環(huán)己烷和水三組分按其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)混合，均勻攪拌后即可配成澄清透明的微乳體系，以作為合成正辛酸甲酯的反應(yīng)體系。酯化反應(yīng)結(jié)束后，用氣相色譜法檢測(cè)正辛酸的轉(zhuǎn)化率，根據(jù)轉(zhuǎn)化率的大小，確定微乳區(qū)的最大反應(yīng)點(diǎn)，并將此最大反應(yīng)點(diǎn)作為研究正辛酸酯化反應(yīng)單因素影響的反應(yīng)點(diǎn)。

1.3 微乳體系中正辛酸甲酯的合成

在圓底燒瓶中分別加入形成微乳體系的3個(gè)組分，磁力攪拌30 min，形成均勻澄清透明的微乳體系。向微乳體系中加入正辛酸和甲醇，在水浴條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)。酯化反應(yīng)產(chǎn)物在Agilent 689 0N氣相色譜儀上進(jìn)行定量分析，F(xiàn)ID 檢測(cè)器，HP-5毛細(xì)管柱，月桂酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 含水量w0對(duì)酯化反應(yīng)的影響

圖1為DBSA/環(huán)己烷/水體系的三組分相圖。由圖1可以看出，微乳區(qū)域較小，多相體系(即非微乳區(qū))較大；在微乳區(qū)內(nèi)，DBSA與環(huán)己烷在少量水存在下即可互溶，形成均勻澄清的反應(yīng)體系。

圖1 DBSA/環(huán)己烷/水體系的三組分相圖

微乳體系中，水的含量用w0表示，它是指水與表面活性劑DBSA的物質(zhì)的量之比。w0對(duì)DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中正辛酸甲酯的產(chǎn)率有著重要影響，具體反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，有無(wú)脂肪酶存在條件下，微乳體系水的含量w0和正辛酸甲酯產(chǎn)率的變化關(guān)系均像鐘形輪廓形狀，并在w0=3時(shí)有最大轉(zhuǎn)化率。一般來(lái)說(shuō)，微乳體系中，酯化反應(yīng)發(fā)生在相界面處，相界面處的面積越大，底物分子間的接觸越充分，從而增加反應(yīng)速度，提高反應(yīng)產(chǎn)率。隨著w0值(1～3)的增加，界面增加，同時(shí)反應(yīng)過(guò)程中生成的水參與微乳體系的形成，有利于反應(yīng)平衡進(jìn)一步向右移動(dòng)，正辛酸甲酯的收率增加。對(duì)于有酶體系來(lái)說(shuō)，低w0時(shí)，水主要與表面活性劑結(jié)合，而使酶保持活性構(gòu)象所需的自由水較少，從而抑制酶的活力，隨著w0的增大，自由水增多，酶的活性增大，反應(yīng)速度加快，酯化率增加。當(dāng)w0值增加到一定程度時(shí)，過(guò)量水的存在可使微乳體系轉(zhuǎn)變?yōu)槿闈嵋夯蛘卟环€(wěn)定體系，相接觸面積減少，反應(yīng)速度降低，對(duì)有酶體系來(lái)說(shuō)，過(guò)量的水還使得酶分子周圍的水殼太厚, 不利于酶與底物的充分接觸, 從而影響酶活性的充分發(fā)揮。另外過(guò)量水將使酯化反應(yīng)平衡向逆反應(yīng)方向進(jìn)行，促進(jìn)水解反應(yīng)，降低轉(zhuǎn)化率，因此，試驗(yàn)中選擇微乳體系中含水量w0=3為宜。

圖2 含水量w0對(duì)酯化反應(yīng)的影響

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響

正辛酸0.5 mmol，醇酸物質(zhì)的量比10∶1，w0=3，反應(yīng)4.0 h條件下，考察DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中不同反應(yīng)溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，無(wú)論在不加酶微乳體系和加酶微乳體系中，隨著反應(yīng)溫度的升高，轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，在40 ℃以后轉(zhuǎn)化率趨于平緩下降，與通常動(dòng)力學(xué)反應(yīng)規(guī)律相同。這是因?yàn)樵诘蜏貢r(shí)，溫度的升高有利于DBSA的酸催化作用，當(dāng)T=40 ℃時(shí)，反應(yīng)基本達(dá)到平衡，正辛酸甲酯收率達(dá)到最高為87.7%，進(jìn)一步增加反應(yīng)溫度，即T>40 ℃時(shí)，此時(shí)雖然DBSA的酸催化作用增強(qiáng)，但是隨著溫度的升高，微乳體系越來(lái)越不穩(wěn)定，同時(shí)酯水解反應(yīng)活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為酯化率并沒(méi)有隨溫度的升高而增強(qiáng)，反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，無(wú)酶存在時(shí)反應(yīng)溫度控制在40 ℃為宜。由圖3亦知，低溫酶存在時(shí)，酶催化反應(yīng)活力隨溫度的升高而增強(qiáng)，40 ℃時(shí)酶催化反應(yīng)活性達(dá)最大，辛酸甲酯收率最高為92.1%。進(jìn)一步增加反應(yīng)溫度，即溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，酶催化反應(yīng)酯化率有下降趨勢(shì)。由于高溫常使酶難以保持活性構(gòu)象，從而降低酶活力，導(dǎo)致反應(yīng)速率隨溫度身高而降低，而高溫提高了DBSA 的酸催化作用，兩者相互作用的結(jié)果，使得辛酸甲酯的收率并未出現(xiàn)明顯降低。進(jìn)一步增加反應(yīng)溫度，酶活力進(jìn)一步降低，此時(shí)DBSA催化的酯水解副反應(yīng)活性增加，從而酯化率降低。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響

正辛酸0.5 mmol，醇酸物質(zhì)的量比為10∶1，w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃條件下，考察DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響

由圖4可見(jiàn)，有無(wú)脂肪酶存在時(shí)，該微乳體系進(jìn)行酯化反應(yīng)時(shí)均具有較好的催化活性，說(shuō)明該微乳體系中，DBSA具有雙重作用，除作為表面活性劑與環(huán)己烷、水形成微乳體系外，還可作為Br?nsted酸對(duì)酯化反應(yīng)具有一定的催化能力。脂肪酶存在下，反應(yīng)3.0 h時(shí)，酯化率即達(dá)到86.5%，無(wú)酶存在時(shí)酯化率為77.4%。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酯化率逐漸升高，無(wú)酶存在時(shí)酯化反應(yīng)速率增加更明顯。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4.0 h時(shí)，酯化率達(dá)到最大值。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，酯化率基本保持不變。由于酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，過(guò)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間使得正辛酸甲酯的水解反應(yīng)活性增加，因此反應(yīng)時(shí)間以4.0 h為宜。

2.4 醇酸物質(zhì)的量比對(duì)酯化反應(yīng)的影響

酯化反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，常通過(guò)增加反應(yīng)物的量來(lái)提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，圖5為正辛酸0.5 mmol，w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)4.0 h條件下，DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中醇酸物質(zhì)的量比對(duì)酯化反應(yīng)的影響。由圖5可見(jiàn)，有無(wú)脂肪酶存在條件下醇酸物質(zhì)的量比對(duì)酯化反應(yīng)的影響均較大。在所考察的范圍內(nèi)，隨著甲醇用量的增加，酯化率逐漸上升，當(dāng)醇酸物質(zhì)的量比超過(guò)10∶1時(shí)，酯化率分別達(dá)到92.1%和87.7%，且酶存在時(shí)，醇酸物質(zhì)的量比對(duì)正辛酸甲酯酯化率的影響更明顯。進(jìn)一步增加甲醇用量，酯化率基本保持不變。這是因?yàn)樵龃蠹状嫉挠昧浚欣诜磻?yīng)向生成酯的方向移動(dòng)而提高酯化率，但當(dāng)酸醇摩爾比提高到一定程度后，增加醇的量，此時(shí)反應(yīng)溶液體積增加較大，催化劑濃度相對(duì)變稀，反應(yīng)速度變慢，酯化率有所下降，綜合結(jié)果，辛酸甲酯的收率基本保持不變，因此，醇酸物質(zhì)的量比選為10∶1。

圖5 醇酸物質(zhì)的量比對(duì)酯化反應(yīng)的影響

2.5 脂肪酶用量對(duì)酯化反應(yīng)的影響

正辛酸0.5 mmol，w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)4.0 h條件下，考察DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中酶用量對(duì)酯化反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，加酶量小于6 mg時(shí)，酯化率隨著酶用量的增加迅速上升，當(dāng)加酶量等于6 mg時(shí)，酯化率最大達(dá)92.1%，進(jìn)一步增加酶用量，酯化反應(yīng)的產(chǎn)率趨于穩(wěn)定，不再上升。這可能是因?yàn)楫?dāng)酶的濃度在一定范圍內(nèi)增加時(shí)，隨著酶量的增加，酶分子中有越來(lái)越多的活性部位與底物接觸[21]，從而使酯化反應(yīng)的產(chǎn)率快速增加，但當(dāng)酶的活性部位增加到一定程度時(shí)，可能會(huì)由于蛋白質(zhì)的聚集作用而不再與底物接觸，反應(yīng)速率不再增加。因此選擇加酶量為6 mg。

圖6 加酶量對(duì)酯化反應(yīng)的影響

2.6 緩沖液pH值對(duì)酯化反應(yīng)的影響

酶分子上有許多酸性、堿性氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán), 這些基團(tuán)在不同pH氛圍中常具有不同的解離狀態(tài)，或與反應(yīng)底物間存在一定的相互作用，進(jìn)而影響酶的結(jié)構(gòu)，改變酶催化反應(yīng)活性。試驗(yàn)中考察了不同緩沖體系對(duì)酯化率的影響，見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn)，體系中酶催化酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨pH值呈先增加后減少的趨勢(shì)，pH=7.0時(shí)，酯化率最高為92.1%，這可能由于PPL酶作為生物催化劑，比較適合中性環(huán)境。酸性和堿性條件下都會(huì)使酯化率有不同程度降低，且酸性條件下降低更明顯。這表明酸性對(duì)酶活力有較大影響，同時(shí)酸性增強(qiáng)增加了酯水解反應(yīng)活性，從而酯化反應(yīng)收率大大降低。

圖7 緩沖溶液pH值對(duì)反應(yīng)的影響

2.7 采用響應(yīng)面法優(yōu)化正辛酸甲酯的合成

2.7.1 分析因素的選取及分析方案

根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取含水量、反應(yīng)時(shí)間、醇酸物質(zhì)的量比、加酶量這4個(gè)因素，采用四因素三水平響應(yīng)面分析方法確定正辛酸甲酯制備最佳工藝條件，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表

以A、B、C和D為自變量，以正辛酸甲酯酯化率為響應(yīng)值(Y)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類：一是析因點(diǎn)，自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有24個(gè)析因點(diǎn)；二是零點(diǎn)，為區(qū)域中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.7.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

以酯化率為響應(yīng)值，通過(guò)RSM軟件對(duì)其進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，模型F值為57.50，F(xiàn)>F0.01(14,14)=3.70。模型顯著水平遠(yuǎn)小于0.01，表明二次回歸模型高度顯著。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)為0.982 9，說(shuō)明自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值擬合較好?；貧w方差顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該模型回歸顯著，失擬項(xiàng)不顯著。另外，該模型的變異系數(shù)(C.V)為0.78%，在可接受范圍。變異系數(shù)是衡量每個(gè)平均值偏離情況的參數(shù)，其值越小，重復(fù)性越好。綜合各參數(shù)，該實(shí)驗(yàn)方法可靠，各因素水平區(qū)間設(shè)計(jì)較合理，因此可用該回歸模型預(yù)測(cè)正辛酸甲酯的酯化率。

含水量、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量一次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。含水量、反應(yīng)時(shí)間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量二次項(xiàng)也均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。各因素(含水量、反應(yīng)時(shí)間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量)對(duì)酯化率的影響經(jīng)擬合得到二次多項(xiàng)回歸方程如下：

表3 微乳體系中豬胰脂肪酶催化合成正辛酸

注：*表示該項(xiàng)具有顯著性效應(yīng)；**表示該項(xiàng)具有極顯著效應(yīng)。

Y=+91.91-0.87A+1.18B+2.10C+1.21D-6.14A2-2.33B2-2.41C2-1.87D2-0.28AB-1.23AC-0.040AD-0.065BC-0.87BD-0.16CD

2.7.3 不同因素間的交互影響

借助 Design Expert軟件，依據(jù)回歸方程式來(lái)繪制分析圖。RSM的圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子構(gòu)成的等高線圖和曲面圖，分別見(jiàn)圖8和圖9。響應(yīng)面等高線可以較直觀地反映各因素相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線若呈圓形，則交互作用不顯著；若呈橢圓形，則交互作用顯著[22-23]。

從圖8a～圖8c中看出，橫向的等值線較疏，縱向的等值線較密，這說(shuō)明含水量對(duì)酯化率的影響較大，反應(yīng)時(shí)間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量這3個(gè)因素對(duì)正辛酸甲酯收率的影響則相對(duì)較小。從圖9a～圖9c中看出，反應(yīng)時(shí)間、醇酸物質(zhì)的量比和加酶量分別一定時(shí)，正辛酸甲酯產(chǎn)率隨著含水量的增加先增加后逐漸減少。在圖8b和圖8e中，等高線呈斜橢圓形, 說(shuō)明圖中的兩因素交互作用顯著，與表3方差分析顯著性相符；而其他等高線趨向圓形，兩因素交互作用不明顯，也與方差分析顯著性相符。

圖8 不同因素交互作用影響正辛酸甲酯酯化率的等高線圖

圖9 不同因素交互作用影響正辛酸甲酯酯化率的響應(yīng)面圖

2.7.4 最佳工藝條件

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，制備正辛酸甲酯最佳工藝參數(shù)為：w0=3，反應(yīng)時(shí)間4.01 h，醇酸物質(zhì)的量比11.09，加酶量為6.77 mg，正辛酸甲酯的收率為93.2%?？紤]到實(shí)際操作的方便，將最佳反應(yīng)條件修正為：w0=3，反應(yīng)時(shí)間為4.0 h，醇酸物質(zhì)的量比為11，加酶量為6.5 mg，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得的平均產(chǎn)率為92.8 %，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，這說(shuō)明回歸方程能夠真實(shí)地反映各因素對(duì)酯化率的影響。

3 結(jié)論

3.1 有無(wú)脂肪酶存在時(shí)，DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中制備正辛酸甲酯時(shí)均具有較好的催化活性，PPL脂肪酶存在更有利于反應(yīng)的進(jìn)行。微乳體系中DBSA起雙重作用：一是作為表面活性劑，參與穩(wěn)定微乳體系的形成，增大反應(yīng)物之間的接觸，加快反應(yīng)速率；二是作為Br?nsted酸催化酯化反應(yīng)，提高酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。

3.2 DBSA/環(huán)己烷/水微乳體系中PPL脂肪酶催化合成正辛酸甲酯的較佳工藝條件為：w0=3，反應(yīng)溫度40 ℃，反應(yīng)時(shí)間4.0 h，醇酸物質(zhì)的量比11，加酶量6.5 mg，緩沖液pH=7。在此條件下，酯化率為92.8%。

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