噴射蒸煮結(jié)合超濾技術(shù)制備大豆分離蛋白及其表征

朱樂(lè)平 楊 娟 高志明 楊曉泉 胡 磊 楊薇薇

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院 食物蛋白工程研究中心，廣州 510640)(黑龍江搖籃乳業(yè)股份有限公司，哈爾濱 150000)

大豆?jié)饪s蛋白(Soy protein concentrate, 簡(jiǎn)稱SPC)是采用低變性豆粕除去水溶性或醇溶性非蛋白成分后，所制得的大豆蛋白產(chǎn)品。功能性大豆?jié)饪s蛋白是以大豆?jié)饪s蛋白為原料，通過(guò)蛋白質(zhì)改性制取，可以提高凈蛋白質(zhì)含量，改善整體蛋白質(zhì)氨基酸的可消化利用性，清除可溶性糖分從而減少多種抗?fàn)I養(yǎng)因子的危害，降低美拉德反應(yīng)在大豆加熱過(guò)程中對(duì)賴氨酸利用效率的影響，價(jià)格實(shí)惠，容易獲得。但大豆?jié)饪s蛋白經(jīng)醇提工藝后普遍存在溶解性較低，影響大豆蛋白品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)性的物質(zhì)去除不徹底等問(wèn)題。大豆異黃酮是多酚類植物雌激素，具有預(yù)防癌癥、保護(hù)心血管和防止骨質(zhì)疏松等多種生理活性，但是對(duì)兒童尤其是嬰兒的食用安全性尚存有爭(zhēng)議。

噴射蒸煮技術(shù)(Hydrothermal cooking或 Jet cooking)，是一種利用高溫高剪切力處理樣品的加熱技術(shù)，已經(jīng)被有效的利用到蛋白的提取和結(jié)構(gòu)重組中。Xia等[1]利用噴射蒸煮技術(shù)實(shí)現(xiàn)了制備高品質(zhì)的碎米和米糠蛋白，并通過(guò)蛋白表面疏水性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，有更多具有較低結(jié)合力的疏水作用位點(diǎn)暴露在蛋白分子表面。國(guó)外已經(jīng)有利用噴射蒸煮技術(shù)提高蛋白質(zhì)提取效率和改善蛋白質(zhì)功能特性的研究[2-3]。

超濾技術(shù)是在壓力驅(qū)動(dòng)下篩分小分子物質(zhì)的過(guò)程，其中以切割分子質(zhì)量的大小作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)料液進(jìn)行進(jìn)一步的分離以及濃縮，可以達(dá)到去除一定小分子物質(zhì)的作用。Kumar等[4]已經(jīng)研究了超濾技術(shù)對(duì)大豆蛋白濃縮等方面的應(yīng)用。

為進(jìn)一步解決大豆蛋白配料在應(yīng)用中的安全性及營(yíng)養(yǎng)性的問(wèn)題[5-6]，克服現(xiàn)有加工技術(shù)的局限，改善現(xiàn)有大豆蛋白配料中植物雌激素異黃酮偏高及商業(yè)功能性大豆?jié)饪s蛋白溶解性差、色澤差、功能性受限和感官特性差等方面的不足，本試驗(yàn)對(duì)商業(yè)功能性大豆?jié)饪s蛋白進(jìn)行噴射蒸煮結(jié)合超濾處理制備蛋白的研究，并對(duì)蛋白的相關(guān)特性進(jìn)行了研究，以期在豆基嬰兒配方奶粉、青少年飲料等產(chǎn)品中得以開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

噴射蒸煮發(fā)生器：廣州南聯(lián)食品機(jī)械公司；CR-300 型色彩色差計(jì)：日本Minolta公司；液相色譜儀，1525型泵，4687檢測(cè)器：Waters公司；Rapid N cube-杜馬斯定氮儀：法國(guó)Elementar公司；2501PC-紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；Nano-ZS&MPT-2-Zeta電位及納米粒度分布儀：英國(guó)Malvern公司；CR22G-型冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；JM-S052W中空超濾膜：廣州潔圣膜技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白的制備

噴射蒸煮結(jié)合超濾技術(shù)制備分離蛋白。制備參考Wang等[7]的方法，超濾膜選取截留分子質(zhì)量為80 ku。大豆?jié)饪s蛋白按1∶10的比例加蒸餾水，用2 mol/L的NaOH調(diào)pH 至9.0，于常溫下攪拌2 h，得蛋白乳漿。將蛋白乳漿進(jìn)行膠體磨處理，然后置于噴射蒸煮器中120 ℃處理90 s，采用超濾膜過(guò)濾后用2 mol/L 的HCl調(diào)pH至4.5，酸沉30 min后，25 ℃、3 000 ×g下離心15 min，蛋白沉淀重新溶于7倍體積去離子水中，取可溶組分調(diào)節(jié)pH至7.5，經(jīng)透析、冷凍干燥得蛋白樣品SPC-HTC-UF。

噴射蒸煮制備分離蛋白。不采用超濾膜過(guò)濾，其余操作同SPC-HTC-UF，得對(duì)照樣品SPC-HTC。

普通的酸沉制備分離蛋白。低溫脫脂豆粕，經(jīng)堿溶酸沉提取制備蛋白，采用鄭二麗[8]的方法，得對(duì)照樣品SPI。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量、氮溶指數(shù)和得率的測(cè)定

商務(wù)英語(yǔ)是一種交流較為靈活的英語(yǔ)應(yīng)用方式，商務(wù)英語(yǔ)更多應(yīng)用在對(duì)外貿(mào)易、經(jīng)濟(jì)交流方面，所以掌握口語(yǔ)英語(yǔ)能力是必須的，商務(wù)英語(yǔ)和普通英語(yǔ)最本質(zhì)的區(qū)別在于商務(wù)英語(yǔ)是一種社會(huì)化語(yǔ)言形式。商務(wù)英語(yǔ)在農(nóng)產(chǎn)交易中的應(yīng)用具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

采用Dumas燃燒法測(cè)定樣品的含氮量，天冬氨酸作為氮校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物。稱取100 mg待測(cè)樣品放入錫箔紙內(nèi)進(jìn)行壓片，測(cè)量待測(cè)樣品前，采用2個(gè)空白樣和3個(gè)天冬氨酸樣校準(zhǔn)?？瞻讟訙y(cè)量時(shí)氧氣流量設(shè)定為50 mL/min，其他樣品測(cè)量時(shí)氧氣流量設(shè)定為150 mL /min。蛋白質(zhì)含量=含氮量×6.25。

氮溶指數(shù)(NSI)：蛋白樣品溶于去離子水使其濃度為1%(w/v)，取適量溶液20 ℃、10 000 ×g下離心10 min，采用Lowry法于500 nm 處測(cè)吸光值的方法測(cè)定氮溶指數(shù)。NSI=溶液中可溶性氮含量/溶液中總氮含量×100%。

蛋白質(zhì)得率=蛋白樣品質(zhì)量/原料(脫脂豆粕或SPC)質(zhì)量×100%。

1.2.3 色澤的測(cè)定

采用色彩色差計(jì)測(cè)定色澤[9-10]，W表示白度，L*表示明度，a*和b*表示色度。a*正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠，b*正值表示偏黃，負(fù)值表示偏藍(lán)。W=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2，白度值越高，表明色澤越淺。

1.2.4 Zeta電位測(cè)定

根據(jù)Surh等[11]的方法，測(cè)定1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蛋白溶液pH值從2.0至10.0的Zeta 電位。測(cè)定比色池規(guī)格為1 cm聚苯乙烯池，采用1對(duì)0.45 cm2鉑電極，間距0.4 cm，測(cè)定溫度25 ℃，溫度平衡時(shí)間2 min，重復(fù)測(cè)量3次計(jì)算平均值為測(cè)定值。

1.2.5 異黃酮含量的測(cè)定

測(cè)定方法參考GB/T 23788—2009[12]，略有改動(dòng)。稱取50 mg蛋白樣品，用2.5 mL去離子水溶解，加入木瓜蛋白酶2 400 u/g，在50 ℃、pH 6.5條件下攪拌1 h。加入5 mL甲醇，1 mL 0.1 mol/L HCl，攪拌2 h，然后12 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，上液相測(cè)定。

色譜條件：色譜柱C18，4.6 mm×250 mm，粒度5 μm不銹鋼色譜柱。流動(dòng)相A，乙腈；流動(dòng)相B，磷酸水溶液(pH=3)。流速0.5 mL/min，波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫條件為A(%)/B(%)在0～10 min為12/88，10～23 min為18/82，23～30 min為24/76，30～55 min為30/70，55～56 min為80/20，56～60 min為12/88。

1.2.6 蛋白體外消化性測(cè)定

體外消化試驗(yàn)參考王曉燕[13]的方法，適當(dāng)修改。1 g蛋白樣品溶解于100 mL 0.1 mol/L HCl體系，按照胃蛋白酶與蛋白1∶100的比例37 ℃孵化10 min后加入酶，于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中反應(yīng)60 min后取樣，加入等體積10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸沉淀未消化的蛋白，離心(5 000×g，10 min，20 ℃)后取上清液測(cè)定可溶性氮含量。胃蛋白酶消化產(chǎn)物調(diào)pH至7.0后加入胰蛋白酶，效價(jià)比同胃蛋白酶，恒溫反應(yīng)120 min后同上取樣進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)純度、氮溶指數(shù)及得率

經(jīng)不同處理得到的蛋白純度、氮溶指數(shù)及得率變化如圖1所示。

注：SPI，低溫脫脂豆粕堿溶酸沉法提取制備的大豆分離蛋白；SPC，商業(yè)功能性大豆?jié)饪s蛋白；SPC-HTC，噴射蒸煮制備蛋白；SPC-HTC-UF，噴射蒸煮結(jié)合超濾技術(shù)制備蛋白。圖1 蛋白純度、氮溶指數(shù)和得率

噴射蒸煮結(jié)合超濾處理后，SPC的純度和NSI顯著提高，SPC、HTC和SPC-HTC-UF的純度分別為63.57%、81.62%和84.63%，相比于SPC的NSI(8.77%)，HTC和SPC-HTC-UF的NSI分別增加了17.06%和67.71%，其中超濾對(duì)氮溶指數(shù)的影響相對(duì)不明顯。異黃酮等小分子物質(zhì)的去除是蛋白純度提高的一重要原因，HTC處理提高了NSI的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致[3,5]，原因可能是SPC中難溶的蛋白在高溫、高壓、高剪切力作用下，蛋白分散性增加，粒度減小，從而提高蛋白的溶解性。大豆分離蛋白以其良好的功能性和高蛋白營(yíng)養(yǎng)性被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，功能性大豆?jié)饪s蛋白與之相比，明顯的缺陷在于蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低(70%左右)，溶解性低(NSI<10%)，使其一些功能性質(zhì)比不上大豆分離蛋白[14-15]。從圖1可見(jiàn)，噴射蒸煮結(jié)合超濾技術(shù)制備的分離蛋白SPC-HTC-UF，蛋白純度和NSI均與SPI接近，這表明噴射蒸煮結(jié)合超濾技術(shù)可以改善SPC的某些品質(zhì)，為拓寬其應(yīng)用提供條件。SPC經(jīng)噴射蒸煮處理后，超濾處理使得率下降。

2.2 蛋白的色澤

經(jīng)不同處理得到的蛋白色澤如表1所示。

表1 蛋白的色澤

注：測(cè)量值是3次測(cè)定的平均值，上標(biāo)a～c表示顯著性差異(P<0.05)。

各樣品的白度值有顯著性差異。噴射蒸煮制備的分離蛋白SPC-HTC 比SPC的白度值高，噴射蒸煮結(jié)合超濾技術(shù)制備的分離蛋白SPC-HTC-UF白度值最高，三者均比SPI高。白度值越高，樣品的色澤越淺?？赡苁且?yàn)榇枷础⑺疅崽幚砑俺瑸V去掉了大部分具有色澤的物質(zhì)，還與糖基化程度、所得蛋白的純度、蛋白原料等密切相關(guān)。

2.3 Zeta電位變化

不同pH值條件下蛋白溶液的Zeta 電位變化如圖2所示。

圖2 zeta電位曲線

Zeta電位的絕對(duì)值越大，溶液體系越穩(wěn)定[16]。Zeta電位是對(duì)顆粒之間相互排斥或吸引力的強(qiáng)度的度量，數(shù)值(正或負(fù))越高，越傾向于溶解或分散；數(shù)值(正或負(fù))越低，越傾向于凝結(jié)或凝聚。圖2中Zeta電位的變化一定程度反映了蛋白溶液體系的變化。在pH=4時(shí)，SPC的Zeta電位為負(fù)，經(jīng)處理的SPC-HTC和SPC-HTC-UF為正，表明作用力從負(fù)的靜電排斥力轉(zhuǎn)為正的靜電排斥力。酸性條件下，SPC的最大Zeta電位值出現(xiàn)在pH 2，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的最大Zeta電位值都在pH 3，表明最強(qiáng)靜電排斥力出現(xiàn)的pH條件改變。同時(shí)，等電點(diǎn)也發(fā)生了明顯的向右偏移。一方面由于高溫處理過(guò)程中，蛋白肽鏈展開(kāi)，有更多的帶電氨基酸富集在蛋白表面，同時(shí)一些小分子帶電物質(zhì)被去除，使得Zeta電位發(fā)生變化。由圖2可看出，在pH 2～5的范圍內(nèi)，噴射蒸煮及超濾技術(shù)處理的蛋白zeta電位的絕對(duì)值高于SPC。

2.4 異黃酮含量

大豆異黃酮的含量如圖3所示。

圖3 大豆蛋白的異黃酮含量

本試驗(yàn)監(jiān)測(cè)了在大豆中比較常見(jiàn)和含量較多的6種異黃酮，即大豆糖苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷和染料木素，以其總量計(jì)為大豆異黃酮的含量。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品在液相色譜中峰面積與異黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算得到SPI中異黃酮含量約為0.72 mg/g，SPC中異黃酮含量約為0.15 mg/g，SPC-HTC中異黃酮含量約為0.10 mg/g，SPC-HTC-UF中異黃酮含量約為0.07 mg/g，經(jīng)噴射蒸煮和超濾處理異黃酮含量均降低。各蛋白中的異黃酮類型都以苷元型的大豆異黃酮為主，這可能與糖苷型的異黃酮在加熱、浸泡、堿溶等過(guò)程中更容易損失或者轉(zhuǎn)化有關(guān)，苷元型的異黃酮溶解性差，與大豆蛋白具有更好的天然結(jié)合能力。盡管大豆中大豆異黃酮的含量不高，一般為128 mg/100 g，但對(duì)于雌激素水平較低的嬰兒來(lái)說(shuō)，其劑量仍有風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于雌激素濃度更低的男嬰來(lái)說(shuō)，大豆異黃酮對(duì)雌激素敏感系統(tǒng)可能有負(fù)面影響[17]。有研究表明，天然存在的大豆蛋白與異黃酮結(jié)合牢固，濃縮蛋白難以徹底去除異黃酮。因此，在豆基奶粉的應(yīng)用上，可考慮使用水解蛋白，并在此基礎(chǔ)上再通過(guò)相關(guān)手段進(jìn)一步降低異黃酮含量。

2.5 蛋白的消化特性

蛋白消化特性的變化如圖4。

圖4 蛋白體外消化的氮釋放量

經(jīng)過(guò)胃蛋白酶的消化，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的氮釋放量分別為49.87%和50.23%，遠(yuǎn)高于SPC(16.38%)，在胰蛋白酶消化的階段，SPC-HTC和SPC-HTC-UF的氮釋放量為69.18%和69.88%，遠(yuǎn)高于SPC(33.24%)，同SPC相比，SPC-HTC和SPC-HTC-UF表現(xiàn)了更容易被消化利用。

3 結(jié)論

本研究以商業(yè)功能性大豆?jié)饪s蛋白為原料，采用120 ℃、90 s的噴射蒸煮處理及80 ku的超濾膜制備大豆分離蛋白，并對(duì)其進(jìn)行表征。蛋白純度、氮溶指數(shù)、色澤、穩(wěn)定性有較大改善，異黃酮的含量大大減少，且經(jīng)噴射蒸煮及超濾后的蛋白具有較好的消化性。噴射蒸煮處理可以顯著提高所制備蛋白的溶解性，80 ku超濾膜可以有效降低大豆異黃酮的含量。

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