miR- 196a- 5p抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新

趙華路，姚 南，魏雪菊，王蘭蘭，張俊武，黃 粵，余 佳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 國家醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)因其具有在體外可無限增殖并可分化為體內(nèi)任何種類細(xì)胞的潛能而被廣泛研究[1]。microRNA (miRNA)作為細(xì)胞內(nèi)一類重要的非編碼調(diào)控分子，許多miRNA已被證實(shí)參與了ESC及iPS細(xì)胞的產(chǎn)生和分化過程，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2- 6]。將ESC中miRNA產(chǎn)生和成熟的關(guān)鍵基因Dicer或DGCR8敲除后，ESC均表現(xiàn)出增殖能力不同程度的減弱，且均不能正常向3個(gè)胚層分化，而喪失其全能性[7- 8]。說明miRNA在ESC的自我維持尤其是分化中具有非常關(guān)鍵的作用。且Dicer-/-和DGCR8-/-ESC因可以作為研究miRNA功能的有利工具[7]。

小鼠胚胎干細(xì)胞 (mouse embryonic stem cells，mESC) 早期分化的microRNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示miR- 196a- 5p在胚狀體(embryoid body, EB)發(fā)育過程中表達(dá)上升[9]，但其在mESC中的具體功能及機(jī)制仍然未知。因此，本研究在DGCR8-/-mESC中重新引入了miR- 196a- 5p的表達(dá)，檢測(cè)了miR- 196a- 5p重新表達(dá)后對(duì)于mESC自我更新能力的影響，確定了miR- 196a- 5p在抑制mESC增殖及自我更新中的功能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

野生型小鼠胚胎干細(xì)胞系V6.5及DGCR8-/-小鼠胚胎干細(xì)胞系ES1(北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所汪陽明教授惠贈(zèng))，白血病抑制因子(LIF)(ESG1107，Millipore公司)，DharmaFECT1(Dharmacon公司)，miR- 196a- 5p mimics 及對(duì)照(Dharmacon公司)，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(86R- 1KT，Sigma公司)，Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑(Takara公司)。實(shí)驗(yàn)中所用抗體分別為：Oct4抗體(sc- 5279，Santa Cruz)，TRITC山羊抗鼠IgG(ZF- 0313，中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 mESC的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

mESC培養(yǎng)于M15培養(yǎng)基(15%胎牛血清，2 mmol/L GlutaMAX，0.1 mmol/L 非必需氨基酸，0.1 mmol/L β-巰基乙醇，1 000 U LIF)，經(jīng)0.1% Gelatin處理的細(xì)胞培養(yǎng)板中。

擬胚體(embryoid body，EB)形成實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長期的V6.5細(xì)胞以(1～1.5)×106細(xì)胞/10 cm培養(yǎng)皿的密度接種，使用10 cm Petri Dish培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每天輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，在EB生長的不同天收集細(xì)胞，檢測(cè)miR- 196a- 5p的表達(dá)。

維甲酸(retinoic acid，RA)誘導(dǎo)分化：誘導(dǎo)前1天，將處于對(duì)數(shù)生長期的V6.5細(xì)胞以6×104細(xì)胞/10 cm皿的密度接種。誘導(dǎo)當(dāng)天，培養(yǎng)基更換為無白血病抑制因子，添加終濃度為0.5 mmol/L RA的培養(yǎng)基中，每天換液。于誘導(dǎo)第2、4和6天收集細(xì)胞，用于檢測(cè)miR- 196a- 5p的表達(dá)水平。

1.3 mESC的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天，ES1細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔(6孔板)的密度接種于培養(yǎng)板上，培養(yǎng)于無雙抗的M15培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照DharmaFECT 1操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染3 d后收集細(xì)胞，檢測(cè)各指標(biāo)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

在分化的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，根據(jù)Trizol操作說明，提取細(xì)胞總RNA。提取的總RNA定量后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。使用適量的cDNA作為PCR模板，BioRad CFX- 96進(jìn)行PCR反應(yīng)，SYBR染料實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的量，以U6為內(nèi)參分析miR- 196a- 5p表達(dá)情況。所使用引物序列(表1)。

1.5 集落形成實(shí)驗(yàn)

以500細(xì)胞/孔(6孔板)的密度接種ES1細(xì)胞，待其生長至第5～6天，進(jìn)行堿性磷酸酶染色。首先4%多聚甲醛固定1～2 min，用1×TBST漂洗1遍，加入新鮮配制的反應(yīng)液，室溫避光放置30 min。棄去反應(yīng)液，用1×TBST漂洗1遍。計(jì)數(shù)陽性克隆數(shù)。

表1 Real-time PCR引物Table 1 Primer sequence used for real-time PCR

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

消化收集ES1細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗1遍，用100 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀。逐滴加入400 μL預(yù)冷的無水乙醇。4 ℃固定過夜。取上述固定好的ES細(xì)胞，500 μL PBS(含有1%胎牛血清)漂洗一次，100 μL PBS重懸，5 μL RNase A(0.5 g/L)，37 ℃，溫育30 min。加入12 μL 10×PI溶液(PI 500 μg/mL，0.9% NaCl，1% Triton?X- 100)，4 ℃染30 min。加入500 μL PBS，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定488 nm吸光度值。

1.7 Oct4免疫熒光染色

將ES1細(xì)胞接種到Laminin預(yù)處理(0.5 μg/cm2Laminin于37 ℃處理2 h以上)的細(xì)胞爬片上。待細(xì)胞在爬片上達(dá)到合適的密度，用預(yù)冷的PBS洗兩次。4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗細(xì)胞3次，0.5% Triton X- 100透膜10 min，3% 牛血清白蛋白室溫封閉1 h。1∶100稀釋的Oct4一抗孵育，4 ℃過夜。PBS洗細(xì)胞3次，1∶400稀釋的二抗室溫孵育1 h。PBS洗細(xì)胞4次，并反扣于滴加DAPI的載玻片，避光孵育30 min，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 miR- 196a- 5p在V6.5細(xì)胞分化過程中上調(diào)

在模擬胚胎早期分化的EB形成過程中，miR- 196a- 5p表達(dá)逐漸上升，在EB形成的第8天達(dá)到最高， 表達(dá)量為ES細(xì)胞中的9倍(P<0.001)(圖1A)。在RA誘導(dǎo)的mESC分化過程中，miR- 196a- 5p的表達(dá)量也逐漸升高，分化第6天的表達(dá)量為ES細(xì)胞中的4倍(P<0.01)(圖1B)。

2.2 miR- 196a- 5p能夠抑制ES1細(xì)胞的克隆形成能力

過表達(dá)miR- 196a- 5p的ES1細(xì)胞的集落形成能力與對(duì)照相比明顯下降，所形成的克隆數(shù)量及細(xì)胞的AP活性均明顯下降(圖2A)。且AP染色為陽性的細(xì)胞克隆中分化的集落比例明顯增加，未分化狀態(tài)的克隆數(shù)量以及總集落數(shù)量均明顯減少(圖2B)。

2.3 miR- 196a- 5p可抑制ES1細(xì)胞周期進(jìn)行

mESC增殖旺盛，細(xì)胞周期的分布具有G1期短，S期長的特點(diǎn)。過表達(dá)miR- 196a- 5p的ES1細(xì)胞較對(duì)照組而言，G1期比例明顯增加，S期比例下降，說明miR- 196a- 5p的過表達(dá)能夠抑制G1-S的轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞增殖(圖3)。

2.4 miR- 196a- 5p能夠抑制ES1細(xì)胞的堿性磷酸酶活性及Oct4表達(dá)

mESC細(xì)胞呈AP染色陽性，在ES1細(xì)胞中過表達(dá)miR- 196a- 5p 后AP染色著色較淺，AP活性明顯下降，且細(xì)胞喪失集落形態(tài)(圖4A)。同時(shí)檢測(cè)了維持mESC多能性及自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Oct4的表達(dá)水平，Oct4免疫熒光染色中紅色信號(hào)表示Oct4表達(dá)強(qiáng)弱，藍(lán)色信號(hào)為細(xì)胞系，從圖中可知miR- 196a- 5p 的過表達(dá)也導(dǎo)致了Oct4水平的下降(圖4B)。

A.the expression of miR- 196a- 5p during EB differentiation of mESCs at 2, 4, 6, 8 and 10 days；B.the expression of miR- 196a- 5p during RA-induced differentiation of mESCs at 2,4 and 6 days;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 day

A.colony formation assay of microRNA mimic transfected mESCs; B.number of differentiated and undifferentiated colonies in microRNA mimic transfected mESCs;*P<0.01 compared with scramble control

圖2miR-196a-5p抑制mESC的克隆形成能力
Fig2miR-196a-5psuppressedthecolonyformationofmESCs(n=3)

The cell cycle distribution of mESCs transfected with microRNA mimics; *P<0.01 compared with Scramble control 圖3 miR- 196a- 5p可抑制mESC細(xì)胞周期進(jìn)行Fig 3 miR- 196a- 5p inhibit cell cycle progression of mESCs(n=3)

A.miR- 196a- 5p suppressed AP activity of ES1 cell compared with the scramble control； B.miR- 196a- 5p suppressed Oct4 expression of ES1 cell compared with the scramble control

圖4miR-196a-5p能夠抑制mESC的AP活性及Oct4表達(dá)
Fig4miR-196a-5psuppressedAPactivityandOct4expressionofmESCs(×40)

3 討論

MicroRNA對(duì)ES細(xì)胞狀態(tài)的維持發(fā)揮著重要調(diào)控作用，現(xiàn)已知多種microRNA影響ES細(xì)胞的自我更新和分化潛能；目前對(duì)以ES特異的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)microRNA(ES cell-specific cell cycle regulating microRNA，ESCC miRNA)為代表的促進(jìn)ES細(xì)胞自我更新的microRNA的研究較為廣泛[10- 11]，而對(duì)于抑制ES細(xì)胞自我更新，促進(jìn)ES細(xì)胞分化的microRNA研究相對(duì)較少。DGCR8-/-胚胎干細(xì)胞因其中不含有任何內(nèi)源性的miRNA分子，可以作為研究miRNA功能的有利工具，當(dāng)在DGCR8-/-胚胎干細(xì)胞中導(dǎo)入單個(gè)microRNA時(shí)，無其余microRNA的拮抗或調(diào)控影響，從而能快速準(zhǔn)確的觀察到導(dǎo)入的microRNA引起的功能變化。目前該細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于研究microRNA分子在胚胎干細(xì)胞中的功能[12]。通過在DGCR8-/-胚胎干細(xì)胞中重新引入miR- 196a- 5p表達(dá)，并通過多種指標(biāo)檢測(cè)了miR- 196a- 5p對(duì)于ES細(xì)胞自我更新的影響，揭示了其在ES細(xì)胞自我更新維持中的負(fù)調(diào)控作用，對(duì)于ES細(xì)胞分化機(jī)制的研究具有積極意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR- 196a- 5p在mESC中處于一種低表達(dá)狀態(tài)，而在mESC進(jìn)入分化狀態(tài)后，其表達(dá)便明顯上調(diào)，而miR- 196a- 5p能夠抑制ES細(xì)胞的增殖及自我更新，所以miR- 196a- 5p的表達(dá)上升則會(huì)進(jìn)一步促使ES細(xì)胞脫離自我更新狀態(tài)，進(jìn)入分化程序。因此miR- 196a- 5p在分化過程中的表達(dá)上調(diào)或許是ES細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)所必需的。而miR- 196a- 5p抑制ES細(xì)胞自我更新的具體機(jī)制及其在ES細(xì)胞分化進(jìn)行中發(fā)揮的促進(jìn)作用還需要進(jìn)一步研究。

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