肝癌組織中KLF17的表達(dá)及臨床意義

孫 昭，趙 林，周 娜，高鶴麗，馬春亮，韓 欽

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 1.北京協(xié)和醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,北京 100730；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 組織工程研究中心，北京 100005)

肝癌已成為全球第5種最常見的惡性腫瘤[1]，在中國(guó)肝癌發(fā)病率男性居第5位,女性居第6位；病死率男性居第2位,女性居第5位。因此肝癌在中國(guó)目前是僅次于肺癌的最主要惡性腫瘤,每年發(fā)病和死亡人數(shù)分別約36萬(wàn)和35萬(wàn),并有繼續(xù)增高的趨勢(shì)[2]，研究肝癌的分子生物學(xué)標(biāo)志物，可以為肝癌的預(yù)后的預(yù)測(cè)提供新的指標(biāo)或者為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子kruppel-like factors,KLFs)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,其典型結(jié)構(gòu)特征是在其羧基端具有3個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，廣泛參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等的調(diào)控。KLFs不僅在生理過程中有重要的作用，近來的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中也起到重要的作用，KLF家族的新成員KLF17已經(jīng)在多種腫瘤中被證明為一種抑癌基因，其表達(dá)的下調(diào)和腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)。在胃癌[3]，肺癌[4]和乳腺癌[5]組織中KLF17的表達(dá)均低于癌旁的正常組織，而且在腫瘤組織中KLF17表達(dá)高的患者生存期更長(zhǎng)。在既往的研究中[6- 7]發(fā)現(xiàn)KLF17在肝癌細(xì)胞系中可以通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。為了進(jìn)一步研究KLF17在肝癌中的作用，首先研究了KLF17在肝癌組織中的蛋白水平的表達(dá)和患者預(yù)后的關(guān)系，然后在肝癌原代培養(yǎng)的細(xì)胞中研究了KLF17的功能。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2009年1月至2011年12月在北京協(xié)和醫(yī)院肝膽外科手術(shù)的肝細(xì)胞肝癌者，經(jīng)病理科確診為肝細(xì)胞肝癌，全部為R0切除，有明確的隨訪結(jié)果，可以進(jìn)行評(píng)估的患者一共36人，其中男性29人，女性7人；平均年齡55.2±11.5，(中位年齡56歲)；KPS分均≥80，根據(jù)巴塞羅那分期，A期 18人(50.0%)，B期13人(36.1%)，C期5人(13.9%)；病理低分化16人(44.4%)，中分化12人(33.3%)，高分化8人(22.3%)；甲胎蛋白≥400 U/mL的19人(52.8%)。隨訪截至2013- 06- 30，中位隨訪時(shí)間25個(gè)月。

1.2 免疫組合法檢測(cè)KLF17在肝癌組織中的表達(dá)

石蠟組織切片常規(guī)脫蠟，檸檬酸緩沖液微波修復(fù)，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，山羊血清封閉，加抗KLF17的抗體(Genetex)，4 ℃過夜。加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育60 min。加鏈霉素抗生物素，室溫下孵育30 min。DAB顯色，封片，在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。免疫組合染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn): 不著色0分, 淺棕色1分,棕色2分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn): 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%者0分;10%～40%者1分;40%～70%者2分; ≥70% 者3分。兩種評(píng)分相加0～2分為低表達(dá); 3～5分為高表達(dá)。

1.3 肝癌原代細(xì)胞系

Hep11和Hep12細(xì)胞系分別分離自同一肝細(xì)胞肝癌患者的原發(fā)灶和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院王歈博士贈(zèng)送)。培養(yǎng)體系為RMPI1640培養(yǎng)基加20% FBS。

1.4 肝癌細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

肝癌細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)在Transwell(Costa)小室中進(jìn)行，侵襲實(shí)驗(yàn)的小室預(yù)先鋪ECM膠。培養(yǎng)的細(xì)胞常規(guī)消化計(jì)數(shù)，用無血清培養(yǎng)基重懸，200 μL的細(xì)胞懸液(1×106cells/mL)在轉(zhuǎn)染48 h后加入Transwell的上室，下室加入含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基500 μL，分別在24和72 h后固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.5 RNA抽提和定量PCR檢測(cè)

Trizol法抽提總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，KLF17表達(dá)水平用定量PCR的SYBR法檢測(cè)，內(nèi)參為GAPDH。KLF17的引物序列為5′-CCAACCATTCAG CACTTTCCT-3′; 5′-AGTAGCTCATACCACGCTCAG-3′；GAPDH的引物序列為5′-GGTCACCAGGGCTGC TTTTA-3′; 5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3′。

1.6 蛋白質(zhì)提取和Western blot檢測(cè)

提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法定量，各組取40 mg總蛋白進(jìn)行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上， KLF17一抗(Genentex)1∶1 000 4 ℃過夜，內(nèi)參為GAPDH(Santa Cruz)，二抗室溫孵育1 h，ECL熒光顯色，照相。

1.7 肝癌原代細(xì)胞Hep11的KLF17表達(dá)的干擾

KLF17的干擾的靶序列為5′-CGACAGTACCTT CTGACGAAAC-3′，轉(zhuǎn)染用Amaxa Nucleofector?核電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染，程序?yàn)門028。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件(版本19.0)，計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)，計(jì)量資料用成組t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)或四格表確切概率檢驗(yàn)，生存數(shù)據(jù)分析采用Kaplan-Meier法和壽命表法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；對(duì)影響生存預(yù)后的聯(lián)合效應(yīng)采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 KLF17在患者肝癌組織中的表達(dá)

在36名肝癌患者中，免疫組化檢測(cè)KLF17，其中有19人(52.8%)為3～5分，17人(47.2%)0～2分，KLF17免疫組化染色的結(jié)果見圖1，KLF17的表達(dá)和患者的性別，KPS評(píng)分，巴塞羅那分期，分化，AFP值等臨床特征無關(guān)。

2.2 Cox回歸分析各種危險(xiǎn)因素對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響

Cox回歸分析了性別，年齡，甲胎蛋白，分化程度，巴塞羅那分期，術(shù)后介入化療，KLF17表達(dá)對(duì)患者無進(jìn)展生存(disease free survival，DFS)和總生存(overall survival,OS)的影響，其中巴塞羅那分期和KLF17對(duì)DFS和OS有影響，發(fā)現(xiàn)巴塞羅那分期在DFS的相對(duì)危險(xiǎn)度(relative risk，RR)為3.1，P<0.05，KLF17 3～5分的RR為0.2，P<0.05，其他因素沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在OS中，巴塞羅那分期的RR為5.6，P<0.05，KLF17的RR是0.1，P<0.05，其他因素沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 單因素分析KLF17對(duì)DFS和OS的影響

根據(jù)KLF17表達(dá)情況分為兩組， KLF17免疫組化評(píng)分0～2分的DFS為23.4±4.9個(gè)月(95%可信區(qū)間為13.2～32.3個(gè)月)，3～5分的DFS為39.3±4.2個(gè)月(95%可信區(qū)間為31.1～47.5個(gè)月)，P<0.05。KLF17評(píng)分為0～2分的OS為35.2±4.2個(gè)月(95%可信區(qū)間27.0～43.4個(gè)月)3～5分的OS為46.9±3.2(95%可信區(qū)間40.1～53.2個(gè)月)，KLF173～5分和0～2分的DFS和OS均有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 Hep11和Hep12肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的比較

培養(yǎng)自肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)灶的Hep12的遷移和侵襲能力顯著高于Hep11(P<0.05, 圖2A，B)，而Hep12的KLF17在mRNA和蛋白水平均顯著低于Hep11(圖2C，D)。

2.5 Hep11細(xì)胞KLF17干擾后遷移和侵襲能力上調(diào)

Hep11細(xì)胞轉(zhuǎn)染KLF17的干擾序列后，定量PCR和Western blot檢測(cè)干擾有效(圖3A，B)，KLF17干擾組和無關(guān)序列干擾組比較遷移和侵襲能力顯著增加(P<0.05)(圖3C，D)。

3 討論

本研究首先用免疫組化法檢測(cè)了肝癌患者石蠟包埋保存的腫瘤組織中KLF17的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KLF17主要表達(dá)于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而KLF17的表達(dá)和患者的分期，分化，性別，甲胎蛋白等都沒有相關(guān)性，但是KLF17表達(dá)免疫組化評(píng)分高于3分的患者，無進(jìn)展生存期和總生存期均較長(zhǎng)，從而證實(shí)了KLF17在蛋白水平的表達(dá)和肝癌預(yù)后有顯著的相關(guān)性，這和以前報(bào)道的肝癌新鮮冰凍組織中KLF17mRNA表達(dá)較高的患者5年生存率更高的結(jié)果是一致的[6]。

為了進(jìn)一步研究KLF17調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制，從同一患者原發(fā)灶和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶分離出來的Hep11和Hep12原代培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞被選中為研究對(duì)象，在體外研究中發(fā)現(xiàn)Hep12的遷移和侵襲能力顯著高于Hep11，而且Hep12的KLF17在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著低于Hep11，那么KLF17表達(dá)水平是否影響肝癌的侵襲遷移能力呢，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)KLF17表達(dá)后，Hep11遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，從而證明KLF17在肝癌中確實(shí)具有調(diào)控轉(zhuǎn)移的功能。

A.negative; B.light brown; C.brown 圖1 肝癌的KLF17的免疫組化Fig 1 Immunohistochemistry of KLF17 inHepatocellular carcinoma(×400)

A.microscopic image of crystal violet staining of transwell (compare the migration and invasion of Hep11 and Hep12; B.transwell migration (n=4) and invasion (n=4) assays showed that Hep12 had greater migratory and invasive potentials than Hep11，*P<0.05 compared with Hep11; C.KLF17 protein expression in Hep11 and Hep12; D.KLF17 mRNA expression in Hep11 and Hep12,*P<0.05 compared with Hep11

圖2Hep11和Hep12遷移侵襲以及KLF17表達(dá)的比較
Fig2ComparisonofHep11andHep12characteristics(×200)

A.Western blot showed that KLF17 were down regulated in Hep11 cells transfected with the KLF17 siRNA; B.real time PCR showed that KLF17 were down regulated in Hep11 cells transfected with the KLF17 siRNA,*P<0.05 compared with control; C.microscopic image of crystal violet staining of transwell (compare the migration and invasion of Hep11 transfected with KLF17 siRNA and control; D.transwell migration (n=4) and invasion (n=4) assays showed that Hep11 cells that were transfected with the KLF17 siRNA (200 nmol/L) had greater invasive and migratory potentials than the control,*P<0.05 compared with control

圖3Hep11的KLF17干擾后侵襲和遷移增加
Fig3KLF17regulatedHep11cellmigrationandinvasion(×200)

總之，肝癌細(xì)胞質(zhì)高表達(dá)KLF17是肝癌預(yù)后較好的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素之一，其機(jī)制可能是KLF17具有抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。

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