Shh促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2的成骨分化

李 麗，董 謙，馮巧靈，王玉鳳，何通川，羅進(jìn)勇

(重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有極強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，常作為種子細(xì)胞修復(fù)、重建受傷或發(fā)生病變的多種組織器官，目前在骨再生研究中應(yīng)用廣泛[1- 2]。

MSCs在定向成骨分化過(guò)程中受多種細(xì)胞因子調(diào)控，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)家族發(fā)揮了重要作用。BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transform growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一，目前已分離和鑒定出20余種，其中BMP2和BMP7已應(yīng)用于臨床[1,3]。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)：BMP2-BMP15中，BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的能力最強(qiáng)[3]。

Shh是由SHH (Sonic Hedgehog)編碼的一種分泌型糖蛋白，可與細(xì)胞膜上跨膜受體Patched結(jié)合活化另一跨膜受體Smoothened，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Gli轉(zhuǎn)錄因子的活性而激活SHH信號(hào)通路。有研究報(bào)道在脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)過(guò)程中BMP2和BMP4可與SHH共同調(diào)控骨骼的形成[4- 5]。然而對(duì)于Shh是否可以調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的作用目前并不清楚。因此，本研究旨在觀察Shh對(duì)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的影響，并初步探討其可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

腺病毒Ad-Shh和Ad-RFP(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，Ad-BMP9和p12SBE-luc(芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心何通川教授惠贈(zèng))；C3H10T1/2和HCT116 細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，ALP定量檢測(cè)試劑盒(BD公司)；Naphthol AS-MX 堿性磷酸酶溶液、Fast Blue RR Salt、茜素紅S、β-磷酸甘油和維生素C(Sigma公司)；Lipofectamin2000TM(Invitrogen公司)；熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega公司)；PCR引物(上海百力格公司)；一抗β-actin、OPN、OCN、Runx2、DLX5、BMP9和總Smad1/5/8(Santa Cruz公司)，一抗Phosphor-Smad1/5/8(Cell Signaling公司)；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：C3H10T1/2和HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清和100 mmol/L的青霉素以及100 g/L的鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2.2 條件培養(yǎng)基的制備：接種HCT116細(xì)胞于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)感染適當(dāng)?shù)味鹊腁d-BMP9，4～6 h后換為無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別收集24和48 h的上清液[6]。

1.2.3 C3H10T1/2細(xì)胞的分化誘導(dǎo)：將C3H10T1/2細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞匯合至30%～40%時(shí)加入適當(dāng)?shù)味鹊?Ad-Shh或Ad-RFP，24 h后加入BMP9條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行ALP和鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)(鈣鹽誘導(dǎo)時(shí)需加入50 mg/L的維生素C和10 mmol/L的β-磷酸甘油)。

1.2.4 ALP活性的測(cè)定和染色：C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)5或7 d，棄去培養(yǎng)基，加入裂解液后離心取上清，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行ALP活性測(cè)定。棄去培養(yǎng)基后加入0.1 g/L色酚AS-MX(Naphthol AS-MX)堿性磷酸酶溶液和0.6 g/L 固牢藍(lán)(Fast Blue RR Salt)混合液200 μL進(jìn)行ALP染色，避光30 min后觀察染色結(jié)果。

1.2.5 鈣鹽沉積實(shí)驗(yàn)：C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)14 d后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，每孔加入0.4%的戊二醛固定10 min后雙蒸水(ddH2O)終止并加入0.4%茜素紅S染液300 μL，待出現(xiàn)紅色鈣鹽物質(zhì)沉積時(shí)棄去染液，ddH2O終止反應(yīng)并洗滌，在顯微鏡下觀察鈣鹽結(jié)節(jié)并成像。

1.2.6 熒光素酶活性的檢測(cè)：C3H10T1/2細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞匯合至30%時(shí)換為無(wú)血清無(wú)雙抗的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基)，同時(shí)用Lipofectamin2000TM轉(zhuǎn)染p12SBE-luc質(zhì)粒3 μg，4～6 h后換為新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，將細(xì)胞接種于24孔板中，待貼壁后加入處理因素，分別檢測(cè)24和36 h的熒光素酶活性。

1.2.7 RT-PCR：C3H10T1/2細(xì)胞接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合至50%時(shí)加入處理因素，在所需時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備成cDNA，小鼠GAPDH基因作為內(nèi)參照，RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.8 Western blot：C3H10T1/2細(xì)胞接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入處理因素后在所需時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總蛋白，按步驟進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The sequence of primers for RT-PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Shh不影響C3H10T1/2細(xì)胞中內(nèi)源性BMP9的表達(dá)

Ad-Shh感染C3H10T1/2細(xì)胞(圖1A)，感染24 h時(shí)Shh的mRNA表達(dá)量增加(P<0.05)(圖1B)，48 h時(shí)，內(nèi)源性BMP9的mRNA及蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化(圖1C，D)。

2.2 Shh促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞早期成骨分化

5和7 d時(shí)，Shh促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的早期成骨指標(biāo)ALP的活性(P<0.05)(圖2A)，ALP染色明顯增強(qiáng)(圖2B)。

2.3 Shh促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞晚期成骨分化

14 d時(shí)，Shh促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的晚期成骨指標(biāo)鈣鹽沉積(圖3A)。Shh促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的晚期成骨指標(biāo)OPN和OCN的mRNA(9 d)及蛋白(11 d)的表達(dá)(P<0.05)(圖3B，C)。

2.4 Shh促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的成骨相關(guān)基因的表達(dá)

1和3 d時(shí)，Shh增強(qiáng)了BMP9誘導(dǎo)的Id1、Id2、Id3、Runx2和CTGF的mRNA水平(P<0.05)(圖4A)。48 h時(shí)，Shh可增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)的Runx2及DLX5的蛋白表達(dá)(P<0.05)(圖4B，C)。

2.5 Shh對(duì)BMP9誘導(dǎo)的經(jīng)典Smad信號(hào)通路的影響

Shh使BMP9誘導(dǎo)的熒光素酶活性增強(qiáng)(P<0.05)(圖5A)。30min時(shí)，Shh并未影響B(tài)MP9誘導(dǎo)的Smad1/5/8的磷酸化(圖5B)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的能力最強(qiáng)[3]。大量研究表明，經(jīng)典Smad、核受體PPARγ、經(jīng)典Wnt/β-catenin、Notch和TGF-β等信號(hào)通路在BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用， 形成復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[7- 8]。有研究報(bào)道SHH也可調(diào)控成骨分化和骨形成[4- 5]，但具體作用并不清楚。所以本實(shí)驗(yàn)主要研究Shh是否可調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化。

A.Ad-Shh can infect C3H10T1/2 cells(×100); B.expression of Shh detected by RT-PCR,*P<0.05 compared with Ad-RFP group; C, D.endogenous expression of BMP9 detected by RT-PCR and Western blot

圖1Shh不改變內(nèi)源性BMP9的表達(dá)
Fig1ShhdonotchangeendogenousexpressionofBMP9

A.ALP activity determined by ALP quantitative assay, *P<0.05 compared with RFP+BMP9 group; B.ALP staining assay 圖2 Shh促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞早期成骨分化Fig 2 Shh enhances BMP9-induced early osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells

A.calcium depositon detected by Alizarin Red S(×100); B, C.expressions of OPN and OCN detected by RT-PCR and Western blot,*P<0.05 compared with BMP9 group

圖3Shh促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞晚期成骨分化
Fig3ShhenhancesBMP9-inducedlaterosteogenicdifferentiationofC3H10T1/2cells

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Shh促進(jìn)了BMP9 誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的早期成骨指標(biāo)ALP和晚期成骨指標(biāo)OPN、OCN的表達(dá)以及鈣鹽沉積，也促進(jìn)了BMP9 誘導(dǎo)的成骨相關(guān)基因Id1、Id2、Id3、CTGF、DLX5和Runx2的表達(dá)。質(zhì)粒p12SBE-luc在報(bào)告基因前插入了12個(gè)連續(xù)的Smad蛋白結(jié)合元件(Smad binding element，SBE)， Smad經(jīng)典途徑激活后可啟動(dòng)熒光素酶的表達(dá)[6]。觀察機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)Shh增強(qiáng)了BMP9誘導(dǎo)的Smad的熒光素酶活性，但并未改變其磷酸化水平，這可能是由于SHH下游轉(zhuǎn)錄因子Gli直接作用于Smad所致。因此后續(xù)將通過(guò)IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Gli與Smad之間的作用。

A.expressions of Id1, Id2, Id3, Runx2 and CTGF detected by RT-PCR,*P<0.05 compared with BMP9 group; B,C.expressions of Runx2 and DLX5 detected by Western blot,*P<0.05 compared with BMP9 group

圖4Shh促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的成骨相關(guān)基因的表達(dá)
Fig4ShhenhancesBMP9-inducedexpressionofosteogenesisrelatedgenes

A.SBE luciferase activity detected at 24 and 36 hours,*P<0.05 compared with BMP9 group; B.Shh did not change the phosphorylated form of Smad1/5/8 determined by Western blot

圖5Shh對(duì)BMP9誘導(dǎo)的經(jīng)典Smad信號(hào)通路的影響
Fig5EffectofShhonBMP9-inducedactivationofcanonicalSmadpathway

有研究報(bào)道Hedgehog信號(hào)通路可通過(guò)Gli2調(diào)控成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)從而調(diào)節(jié)成骨分化[9]，接下來(lái)將通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)探討Gli與BMP9下游成骨基因之間的關(guān)系。另外，還將構(gòu)建Shh和Gli的干擾腺病毒，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)Shh調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的作用及其機(jī)制進(jìn)行更深入的分析。

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