活性氧介導(dǎo)鐵過載對正常及輻射損傷小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

張宇辰，李德冠，孟愛民，柴 笑，孟娟霞，趙明峰*

(1.天津醫(yī)科大學(xué) 一中心臨床學(xué)院 天津市第一中心醫(yī)院 血液科，天津 300192； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射醫(yī)學(xué)研究所 放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)天津市重點(diǎn)實驗室， 天津 300192)

鐵是人體必需的微量元素之一，但在體內(nèi)過度沉積可導(dǎo)致重要臟器(如心臟、肝臟、腎臟及內(nèi)分泌系統(tǒng))的結(jié)構(gòu)損害和功能障礙。臨床上鐵過載分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類[1]。鐵過載可以介導(dǎo)ROS升高影響骨髓造血干祖細(xì)胞功能從而抑制造血，某些繼發(fā)性鐵過載患者(骨髓纖維化、再生障礙性貧血、MDS)在持續(xù)祛鐵治療后，出現(xiàn)輸血次數(shù)減少或脫離輸血，病情明顯好轉(zhuǎn)[2- 7]。鐵過載還可通過抑制骨質(zhì)成熟及成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成引起骨損害，某些β-地中海貧血的患者在發(fā)生鐵過載后可出現(xiàn)明顯的骨成熟障礙及骨軟化癥[8]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)作為骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，具有干細(xì)胞特性及多向分化能力，同時可分泌多種細(xì)胞因子支持和調(diào)節(jié)造血功能。最新體外研究發(fā)現(xiàn)，鐵過載通過提高M(jìn)SCs內(nèi)的ROS水平抑制其增殖、誘導(dǎo)其凋亡，從而降低其造血支持能力[9]。本研究主要目的為探索鐵過載對骨髓造血微環(huán)境的影響，為今后繼發(fā)性鐵過載患者的治療提供新的方向及靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

右旋糖酐鐵注射液(科莫非)(Pharmacocmos公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，α-MEM培養(yǎng)基及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Hyclone公司)，鈣熒光素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)、堿性磷酸酶試劑盒(ALP kit)(Sigma公司)，CCK8試劑盒(上海貝博生物技術(shù)公司)，ROS檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)。成骨基因引物(ALP、OSN、RUNX2)(上海生工生物有限公司)。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及real-time PCR試劑盒(北京百泰科技有限公司)。

1.2 實驗動物

C57BL/6純系SPF級小鼠，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量在18～20 g之間，(北京華阜康生物科技有限公司)。

1.3 鐵過載及病態(tài)骨髓鐵過載模型建立

利用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，將40只小鼠分為對照組(control)、鐵劑組(Fe)(25 g/L)、照射組(4 Gy)及照射加鐵劑組(IR+Fe)(4 Gy照射加25 g/L鐵劑注射)。Ctrl組小鼠給予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/次，F(xiàn)e組小鼠給予腹腔注射右旋糖酐鐵0.2 mL/次，IR組及IR+Fe組小鼠首先給予4 Gy伽馬射線照射，之后IR組小鼠給予腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/次，IR+Fe組小鼠給予腹腔注射右旋糖酐鐵0.2 mL/次，每3天注射1次，共注射4周。

1.4 MSCs的分離及原代培養(yǎng)

脫頸處死小鼠,根據(jù)文獻(xiàn)[10]從密質(zhì)骨中分離培養(yǎng)MSCs,細(xì)胞匯合80%時，棄去培養(yǎng)液，加入3 mL 0. 25% 胰蛋白酶+0.02% EDTA(37 ℃) 消化，進(jìn)行下一步實驗及指標(biāo)檢測。

1.5 MSCs鐵過載鑒定

調(diào)整P0代MSCs細(xì)胞濃度為1×106/mL，將細(xì)胞懸液混勻取100 μL，甩片固定，普魯士藍(lán)鐵染色，觀察細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒。利用不穩(wěn)定鐵(LIP)可以淬滅鈣熒光素乙酰氧基甲酯(calcein-acetoxymethylester，calcein-AM) 的原理檢測MSCs內(nèi)的LIP水平。將原代細(xì)胞用PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞于PBS中，加入calcein-AM，使其終濃度為0. 125 μmol /L，37 ℃避光溫育15 min，用PBS 洗滌2 次后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.6 MSCs增殖能力檢測

群體倍增時間:將MSCs傳至P1代，取對數(shù)增殖期細(xì)胞，以1×105/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)立3個復(fù)孔，在37 ℃溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90% 匯合時，用胰蛋白酶消化計數(shù)。按以下公式計算MSCs 的倍增時間(doubling time，DT):DT=CT×log2/log(X1/X0)，其中X0是細(xì)胞最初的數(shù)量，X1是細(xì)胞最終的數(shù)量，CT是細(xì)胞培養(yǎng)時間。

根據(jù)CCK8試劑盒說明書進(jìn)行檢測步驟：將細(xì)胞以2.5×104個/孔為最大濃度，半量稀釋為4個濃度梯度，種于96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞溶液，48 h后，每孔加8 μLCCK8試劑，37 ℃孵育3 h后利用分光光度儀檢測A值。

1.7 MSCs的成脂誘導(dǎo)及鑒定

將原代MSC以2×104/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞增殖至板底70%～80%匯合時，更換為成脂誘導(dǎo)完全分化培養(yǎng)基，按照說明書進(jìn)行誘導(dǎo)，細(xì)胞在培養(yǎng)過程中無需傳代，15 d后進(jìn)行油紅-O染色鑒定。

1.8 MSCs的成骨誘導(dǎo)及鑒定

1.8.1 MSCs的成骨誘導(dǎo):將原代以5×104/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞增殖至板底70%～80%匯合時，更換為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑(10%胎牛血清、8～10 mol/L的地塞米松、50 μmol/L的抗壞血酸磷酸鹽、10 μg/mL胰島素、10 mmol/L β-磷酸甘油、1%的雙抗)。每周換液2次，14 d后檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性并進(jìn)行ALP染色，按試劑盒說明書操作，進(jìn)行定量分析。繼續(xù)誘導(dǎo)2周，茜素紅染色檢測細(xì)胞鈣化能力。

1.8.2 MSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)量的檢測: 將各組原代MSCs用胰蛋白酶消化，根據(jù)試劑盒說明書提取RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA、利用real-timePCR測定成骨相關(guān)基因的表達(dá)。根據(jù)公式:改變倍數(shù)=2-ΔΔT，ΔT=實驗組(目的基因-管家基因)-對照組(目的基因-管家基因)，其中管家基因為β-actin，計算基因的相對表達(dá)量。

1.9 ROS的測定

2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dichlorofluorescindiacetate，DCFH-DA) 為非熒光脂類可滲透性成分，能被細(xì)胞內(nèi)的ROS 氧化生成非滲透性熒光成分DCF，故DCF 的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比。檢測細(xì)胞內(nèi)ROS:收集1×106個細(xì)胞，用PBS洗滌后，重懸細(xì)胞于PBS中，加入10 mmol/L的DCFH-DA，使其終濃度為1 μmol/L，在37 ℃避光溫育20 min，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中，流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MSCs原代培養(yǎng)的形態(tài)

在培養(yǎng)48 h后可見類圓形細(xì)胞從骨片中爬出，呈貼壁狀態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)24h后可見更多細(xì)胞爬出環(huán)繞骨片，培養(yǎng)72 h后，可見有集落形成，細(xì)胞變長呈梭形。培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞匯合80%(圖1)。

2.2 MSCs鐵過載的鑒定

鐵劑組、照射加鐵劑組細(xì)胞內(nèi)存在大量鐵顆粒，對照組及照射組細(xì)胞內(nèi)幾乎無鐵顆粒(圖2)。鐵劑組MFI明顯低于對照組，照射加鐵劑組MFI低于照射組(P<0.05)(圖3)。

2.3 鐵過載抑制MSCs的增殖

鐵劑組倍增時間(1.74±0.36 d)長于對照組(1.03±0.17)d(P<0.05)，照射加鐵劑組倍增時間(4.92±0.25)d低于照射組(2.80±0.19)d(P<0.05)。此外，不同濃度梯度下各組細(xì)胞增殖情況不同，鐵劑組與對照組比較，照射加鐵劑組與照射組比較增殖能力有所下降(表1)。

A.at 3 day after initial culture(×100); B.at 7 day after initial culture(×40); C.at 7 day after initial culture(×100) 圖1 密質(zhì)骨分離的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)Fig 1 Morphological features of compact bone-derived mouse mesenchymal stem cells

A.control group; B.iron treated group; C.IR group; D.IR and iron treated group 圖2 MSCs細(xì)胞甩片鐵顆粒染色Fig 2 Microscopic photographs of MSCs stained with Prussian blue(×1 000)

group25×104個/孔125×104個/孔075×104個/孔03725×104個/孔control1225±00281093±00380731±00260428±0047Fe1008±0066?0793±0047?0487±0038?0357±0029IR0795±0037?0637±0035?0433±0029?0374±0076IR+Fe0767±0018?#0596±0049?#0428±0031?0342±0036

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with IR group.

2.4 鐵過載對MSCs成脂油紅-O染色的影響

成脂誘導(dǎo)14 d后，油紅-O染色可發(fā)現(xiàn)鐵劑組及照射加鐵劑組脂滴明顯多于對照組及照射組(圖4)。

2.5 鐵過載抑制MSCs向成骨細(xì)胞分化

MSCs成骨誘導(dǎo)14 d時進(jìn)行ALP染色(圖5)，鐵劑組及照射加鐵劑組細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組及照射組；各組ALP活力不同，鐵劑組ALP積分低于對照組(P<0.05)(圖6)。誘導(dǎo)4周后，進(jìn)行茜素紅染色可發(fā)現(xiàn)鐵劑組及照射加鐵劑組鈣結(jié)節(jié)明顯少于對照組和照射組(P<0.05)(圖7)。

2.6 鐵過載抑制成骨相關(guān)基因表達(dá)

鐵劑組RUNX2表達(dá)量與對照組相比降低， 照射加鐵劑組與照射組相比表達(dá)量下降(P<0.01)；鐵劑組ALP表達(dá)量與對照組相比降低(P<0.01)，

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with IR group圖3 MSCs細(xì)胞內(nèi)可變鐵池的平均熒光強(qiáng)度Fig 3 Calcein fluorescence on the MSCs(±s,n=3)

A.control group; B.iron treated group; C.IR group; D.IR and iron treated group 圖4 間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)油紅O染色Fig 4 Oil red-O stainning of BM-MSCs induced adipocytes in each group (×400)

A.control group; B.iron treated group; C.IR group; D.IR and iron treated group 圖5 成骨細(xì)胞ALP染色照片F(xiàn)ig 5 Microscopic photographs of osteoblast stained with ALP (×400)

*P<0.05 compared with control group圖6 各組成骨誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ALP積分Fig 6 ALP score of BM-BSCs induced osteoblasts

照射加鐵劑組與照射組相比表達(dá)量下降(P>0.05)；鐵劑組OSN表達(dá)量與對照組比較增加(P<0.01)(圖8)。

2.7 鐵過載引起ROS升高

鐵劑組ROS水平高于對照組(P<0.01)；照射加鐵劑組ROS水平明顯高于照射組(P<0.05)(圖9)。

A.control group; B.iron treated group; C.IR group; D.IR and iron treated group圖7 成骨誘導(dǎo)4周后各組茜素紅染色Fig 7 Evaluate mineralized nodule by alizarin red S staining after 4 weeks osteogenesis induction (×100)

3 討論

鐵過載(血色病)，主要原因為鐵在體內(nèi)過度沉積引起，導(dǎo)致重要臟器(尤其是心臟、肝臟、垂體、 胰腺和關(guān)節(jié))的結(jié)構(gòu)損害和功能障礙?？梢娪谶z傳性血色病等遺傳因素及紅系無效造血、長期輸血等繼發(fā)因素造成的機(jī)體內(nèi)鐵吸收過多及代謝障礙。鐵過載發(fā)生時，過量的鐵顆粒主要沉積于造血微環(huán)境。MSCs是造血微環(huán)境的重要組成部分，它通過與造血細(xì)胞直接接觸、分泌細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子及向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化調(diào)控造血，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于保持機(jī)體正常造血功能具有重要意義。其中， 成骨細(xì)胞是構(gòu)建造血微環(huán)境的重要成分并維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[8]。

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with IR group 圖8 鐵過載抑制成骨基因ALP及RUNX2的表達(dá)，并可引起成骨基因OSN表達(dá)升高Fig 8 Iron overload inhibited ALP and RUNX2 expression and increased OSN expression(±s,n=3)

*P<0.01 compared with control group; #P<0.05 compared with IR group圖9 ROS的平均熒光強(qiáng)度(MFI) Fig 9 Mean fluorescence intensity of ROS

根據(jù)密質(zhì)骨及其骨內(nèi)膜富含MSCs并可短期獲得大量這一特性，在本次實驗從密質(zhì)骨中提取MSCs，并成功建立小鼠骨髓MSCs鐵過載模型。鐵過載可以通過介導(dǎo)ROS升高而損傷人骨髓及臍帶MSCs[9]。在小鼠正常及輻射損傷骨髓MSCs鐵過載模型下，鐵劑組及照射加鐵劑組MSC增殖能力明顯下降，同時鐵過載可以抑制小鼠骨髓MSCs向成骨細(xì)胞分化。其主要機(jī)制可能為胞質(zhì)內(nèi)聚集的大量自由鐵能轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，通過Fenton反應(yīng)Haber-Weiss 途徑催化生成大量ROS[11]，ROS不僅引起造血干細(xì)胞衰老[12]還可以抑制MSCs增殖及成骨分化過程中成骨基因ALP及RUNX2表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的形成[13- 14]， ALP是骨質(zhì)鈣化、礦化必需的因子,RUNX2是骨形成蛋白(BMP)信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。其機(jī)制可能是由于ROS下調(diào)細(xì)胞內(nèi)FoxO1的表達(dá)，F(xiàn)oxO1在氧化還原平衡及骨形成過程中起到重要作用[15]。

綜上所述，鐵過載可以通過升高細(xì)胞ROS水平，抑制小鼠骨髓MSCs增殖、降低其向成骨細(xì)胞分化的能力，從而損傷骨髓造血微環(huán)境，損傷骨髓造血功能，并間接造成骨損害。

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