細(xì)胞自噬緩解氧-糖剝奪誘導(dǎo)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血損傷

陳璐勔，羅艷琳，趙 麗，韓 松，李淑娟，李俊發(fā)*

(首都醫(yī)科大學(xué)1.神經(jīng)生物學(xué)系 北京腦重大疾病研究院，北京100069；2.附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100020)

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，并被認(rèn)為是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種重要機(jī)制[1]。關(guān)于自噬在腦缺血和缺血再灌注過(guò)程中的作用一直存在爭(zhēng)議，一些研究者認(rèn)為自噬在腦缺血損傷中起到保護(hù)作用；而另一些學(xué)者則認(rèn)為自噬加重腦缺血損傷。究其原因，可能主要與研究者所選擇的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀嘘P(guān)，即缺血/低氧或再灌注時(shí)間的差異可能造成不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如在大鼠腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型與原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，自噬在缺血/再灌注中起保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用不因再灌注時(shí)間的長(zhǎng)短而改變[2- 4]。然而，其他研究者在不同實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)，隨著氧-糖剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬逐漸對(duì)細(xì)胞起損害作用[5- 6]。這些研究結(jié)果提示，缺血/低氧程度可能對(duì)于研究細(xì)胞自噬在腦缺血性損傷中作用有重要意義。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)擬利用原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模擬離體缺血模型，選擇不同OGD強(qiáng)度并利用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(BafA1)，探討細(xì)胞自噬在OGD誘導(dǎo)神經(jīng)元缺血損傷中作用，并為深入研究神經(jīng)元在不同缺血強(qiáng)度狀態(tài)下，自噬的具體細(xì)胞信號(hào)激活機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)， 出生24 h內(nèi)的C57BL/6J乳鼠，雌雄不拘。購(gòu)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部，SCXK(京)2012- 0001。

1.2 主要試劑

NeurobasalTM、B27、谷氨酰胺、雙抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)和無(wú)糖DMEM(Gibco公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)，兔源性LC3多克隆抗體，Bafilomycin A1(Sigma-Aldrich公司)，兔源性Beclin- 1多克隆抗體和鼠源性β-actin單克隆抗體(Proteintech公司)，CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Promega公司), 3-(4,5-二甲基噻唑-2)- 2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Applichem公司)。

1.3 神經(jīng)元氧-糖剝奪(OGD)模型制備

選用培養(yǎng)8 d生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)元，更換為無(wú)糖培養(yǎng)基，放入37 ℃、通有混合氣體(5% CO2, 2% O2和93% N2)的低氧培養(yǎng)箱。分別于15、30、60、90和120 min后取出，更換為正常培養(yǎng)液，并置于37 ℃、5% CO2飽和的常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。為明確自噬在神經(jīng)元OGD損傷中的作用，自噬抑制劑BafA1在細(xì)胞進(jìn)行OGD前即刻加入，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中保持終濃度為100 nmol/L。

1.4 Western blot檢測(cè)

蛋白樣品制備、SDS-PAGE和Western blot參照文獻(xiàn)[14]。提取全細(xì)胞蛋白、BCA法定量。取30 g蛋白樣品，進(jìn)行電泳(12% SDS-PAGE,4 ℃,20～30 mA)和轉(zhuǎn)膜(PVDF膜,400 mA,1 h)。先后用兔源性抗Beclin- 1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶4 000)進(jìn)行免疫雜交；然后用ECL發(fā)光，X-線片曝光、顯影、定影。Western blot結(jié)果用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.5 MTT比色法

將細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)OGD處理后加入MTT，并避光37 ℃溫浴4 h。MTT可被線粒體內(nèi)脫氫酶還原生成結(jié)晶狀深紫色產(chǎn)物甲臜(formazan)，用DMSO將其完全溶解后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)的吸光度(A490)，來(lái)計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率

在96孔板接種細(xì)胞，按照CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒規(guī)定步驟，定量測(cè)量(A490)細(xì)胞LDH漏出率，來(lái)確定細(xì)胞損傷水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OGD處理對(duì)原代培養(yǎng)腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin- 1表達(dá)水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響

經(jīng)15～120 min OGD/復(fù)糖復(fù)氧(R)24 h處理后，原代培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)Beclin- 1蛋白表達(dá)水平隨OGD處理時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高，且于30 min達(dá)到峰值1.80±0.08倍 (P<0.05) (圖1)。同樣，代表自噬水平的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在OGD處理后15～120 min的變化趨勢(shì)與Beclin- 1蛋白表達(dá)水平相似，均在30 min OGD處理后達(dá)到峰值1.60±0.02倍 (P<0.05) (圖2)。

2.2 自噬抑制劑BafA1對(duì)OGD處理神經(jīng)元內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和缺血損傷的影響

選取自噬最為活躍的時(shí)間點(diǎn)，OGD 30和60 min/R 24 h，觀察神經(jīng)元損傷情況。MTT結(jié)果(圖3A)示，30和60 min OGD/R 24 h神經(jīng)元的存活率分可使神經(jīng)元死亡率分別為(33.1±1.9)%和(39.9±1.4)%。然而，在終濃度100 nmol/L自噬抑制劑BafA1作用下，60 min OGD/R 24 h處理的神經(jīng)元存活率下降為(49.3±1.5)%，較單純60 min OGD/R 24 h處理神經(jīng)元的存活率顯著下降(P<0.05)，同樣，LDH漏出率結(jié)果顯示，BafA1抑制自噬后，30和60 min OGD/R 24 h處理神經(jīng)元死亡率分別增加至(36.8±0.6)%和(51.2±1.5)%，且60 min OGD/R 24 h組神經(jīng)元死亡率顯著增加 (P<0.05) (圖3B)。此外，進(jìn)一步明確了BafA1對(duì)OGD處理神經(jīng)元存活率和死亡率的影響是通過(guò)對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用(P<0.05) (圖4)。

A.the typical result of Western blot showed the changes of Beclin- 1 (60 ku) expression in primary cultured cortical neurons with oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the Beclin- 1 expression increased;*P<0.05 conpared with 0 min OGD (normoxic control)

圖1不同OGD處理時(shí)間對(duì)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)Beclin-1表達(dá)水平的影響
Fig1EffectofOGDexposuretimeonBeclin-1expressionlevelinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

A.the typical result of Western blot showed the changes of LC3Ⅰ (17 ku) and LC3Ⅱ (14 ku) expressions in primary cultured cortical neurons with OGD treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ increased significantly with OGD exposure time；*P<0.05 compared with 0 min OGD (normoxic control)

圖2不同OGD處理時(shí)間對(duì)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響
Fig2EffectofOGDexposuretimeonLC3Ⅱ/Ⅰratioinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

3 討論

細(xì)胞自噬在腦缺血病理生理變化中扮演著重要的角色，明確自噬在腦缺血中發(fā)揮的作用是挽救缺血性腦卒中患者生命的關(guān)鍵[7- 10]。OGD致離體細(xì)胞缺血模型可解決整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)難以解決的問(wèn)題，并避免了諸多體內(nèi)因素的干擾，非常便于觀察藥物的作用， 以及進(jìn)一步探討保護(hù)或損傷的細(xì)胞分子機(jī)制。

A.the results of MTT(cell survival); B.LDH(cell death) assaies demonstrated that autophagy inhibitor BafA1could significantly aggravate 60 min OGD/24 h R-induced ischemic injury in primary cultured cortical neuron of mice;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60min OGD without BafA1treatment

圖3自噬抑制劑BafA1對(duì)30～60minOGD處理神經(jīng)元缺血性損傷的影響

Fig3EffectofautophagyinhibitorBafA1on30～60minOGD-inducedischemicinjuriesinprimaryculturedcorticalneuronofmice(n=6)

The results of typical Western blot and quantitative analysis showed that the autophagy inhibitor BafA1, which is a specific inhibitor of vacuolar H+ ATPase to prevent the fusion between autophagosomes and lysosomes, could significantly induce the accumulation of LC3II in primary cultured cortical neurons after 60 min OGD/24 h R;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60 min OGD

圖4自噬抑制劑BafA1對(duì)60minOGD處理神經(jīng)元內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響

Fig4EffectofautophagyinhibitorBafA1ontheLC3Ⅱ/Ⅰrationinprimaryculturedcorticalneuronsafter60minOGDtreatment(n=6)

因此，原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元OGD模型，可研究缺血/缺氧時(shí)神經(jīng)元自噬是否被激活及其激活程度，更重要的是能更直接地研究神經(jīng)元自噬在缺血/缺氧性損傷中作用，為深入研究腦缺血/低氧性損傷和適應(yīng)機(jī)制打下了良好基礎(chǔ)[11- 14]。本研究結(jié)果表明，離體培養(yǎng)神經(jīng)元經(jīng)OGD/24 h R處理后， OGD1 5 min即可誘發(fā)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的自噬發(fā)生，OGD 30 min即可使神經(jīng)元內(nèi)自噬水平達(dá)到峰值，然而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元自噬水平略微下降，損傷情況加重，提示神經(jīng)元的損傷方式可能已發(fā)生了改變，即凋亡和壞死途徑被觸發(fā)。而細(xì)胞自噬可緩解OGD致小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺血性損傷，并在60 min OGD/R 24 h的保護(hù)作用更明顯。

總之，本實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)神經(jīng)元的缺血性損傷中證實(shí)，自噬可以對(duì)抗OGD致神經(jīng)元的損傷作用，且這種作用與時(shí)間密切相關(guān)，隨著OGD時(shí)間的延長(zhǎng)，其他細(xì)胞死亡方式被觸發(fā)，自噬的保護(hù)作用被削弱。提示臨床上治療缺血性腦卒中不僅要在合適的時(shí)間點(diǎn)發(fā)揮自噬的保護(hù)作用，還要注意抑制其他細(xì)胞死亡方式的發(fā)生?？傊琌GD可誘發(fā)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元自噬發(fā)生，且細(xì)胞自噬可緩解OGD處理腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺血損傷。

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