黃芪減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠血管重塑

裴 芳，王新全，岳榮川，黃 驥，黃 婕，王旭開，于長(zhǎng)青*

(1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì) 重慶市總隊(duì)醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 重慶 400061； 2.第三軍醫(yī)大學(xué) 大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所 心血管內(nèi)科 重慶市心血管病研究所，重慶 400042)

血管重塑與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、支架術(shù)后再狹窄等多種疾病密切相關(guān)[1]。因此，尋找有效干預(yù)血管重塑過(guò)程的藥物并闡明其機(jī)制，將對(duì)上述疾病的防治起關(guān)鍵作用。黃芪是傳統(tǒng)中藥，近年研究發(fā)現(xiàn)黃芪對(duì)心血管系統(tǒng)有多種有益作用[2]，但其對(duì)血管重塑的影響尚不清楚。本研究擬探討黃芪對(duì)血管重塑的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑

SPF級(jí)雄性8周齡、體質(zhì)量(20±2)g C57BL/6小鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2013- 0001]。AngⅡ、 Losartan(氯沙坦)及Masson染色試劑盒(Sigma-Aldrich公司)。黃芪注射液(粗提物；每mL含黃芪甲甙不少于1.0 mg，相當(dāng)于含生藥2 g，即黃芪濃度相當(dāng)于2 g/mL)(成都地奧制藥有限公司)。PCR引物(大連寶生物公司合成)。RNA提取試劑Trizol及RT-PCR試劑盒(Promega公司)。兔抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)及血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor, AT1R)多克隆抗體及小鼠抗β-actin單克隆抗體(Abcam公司)。HRP標(biāo)記的抗兔及小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch公司)。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將40只小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、Ang Ⅱ組，Ang Ⅱ+氯沙坦和Ang Ⅱ+黃芪(astragalus membranaceus)組。其中，對(duì)照組每天灌胃0.2 mL 0.9%氯化鈉注射液1次；Ang Ⅱ 組采用背部埋微滲透泵的方法，以200 ng/(kg·min)的劑量持續(xù)泵入AngⅡ；AngⅡ+ 氯沙坦組在AngⅡ處理的同時(shí)，以10 mg/(kg·d)的劑量每天灌胃1次；AngⅡ+黃芪組在AngⅡ處理的同時(shí)，以20 g/(kg·d)的劑量每天灌胃1次。藥物作用的總時(shí)長(zhǎng)為14 d。

1.2.2 小鼠血壓測(cè)定：采用尾套法，用小鼠血壓儀每天上午8點(diǎn)左右測(cè)定靜息和清醒狀態(tài)下小鼠收縮壓。每2天測(cè)量1次。

1.2.3 血管形態(tài)及纖維化程度檢測(cè)：取第14天小鼠升主動(dòng)脈，并進(jìn)行HE染色和Masson染色，檢測(cè)血管形態(tài)和血管纖維化程度。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)：用去RNA酶的剪刀在冰浴條件下將收集的主動(dòng)脈剪碎，加入Trizol研磨，進(jìn)行酚氯仿抽提和乙醇沉淀獲得RNA。將RNA溶于去RNA酶的水中并測(cè)定濃度。以1 μg RNA為模版，采用RT-PCR試劑盒合成cDNA。以等體積cDNA為模版，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增Ⅰ型膠原蛋白及內(nèi)參GAPDH。Ⅰ型膠原蛋白正、反向引物序列為：正向引物5′-GTGAACCTGGCA AACAAGGT-3′；反向引物5′-CTGGAGACCAGAGAA GCCAC-3′。GAPDH正、反向引物序列為：正向引物 5′-ACATCATCCCTGCATCCACT-3′；反向引物5′-CC TGCTTCACCACCTTCTTG-3′。退火溫度均為58 ℃，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢樣，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并用Quantity One軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行吸光度分析。Ⅰ型膠原蛋白與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值作為各組的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Westerm blot檢測(cè)ACE2及AT1R蛋白表達(dá)：提取主動(dòng)脈組織的總蛋白，用BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組取50 g等量蛋白煮沸變性后，用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳。半干法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h。兔抗ACE2一抗(1∶1 000)、兔抗AT1R一抗(1∶1 000)及小鼠抗β-actin一抗(1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜。HRP標(biāo)記的抗兔及小鼠二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h。采用ECL發(fā)光試劑盒在暗室中膠片成像。掃描后采用Quantity One分析條帶吸光度值。目的蛋白與內(nèi)參β-actin的吸光度比值作為各組的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪對(duì)收縮壓的影響

對(duì)照組及未經(jīng)任何處理小鼠收縮壓約為105 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。給予AngⅡ后，收縮壓隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，第10天以后維持在165 mmHg左右；氯沙坦可以完全對(duì)抗AngⅡ?qū)ρ獕旱挠绊?；黃芪在給藥第6天開始可以顯著降低AngⅡ引起的血壓升高(P<0.05)，且該作用一直持續(xù)到第14天。與氯沙坦治療組相比，黃芪組的血壓在第6～14天之間仍然較高(P<0.05)(圖1)。

2.2 黃芪對(duì)主動(dòng)脈壁厚度及纖維化的影響

與對(duì)照組相比，AngⅡ處理14 d后，主動(dòng)脈管壁厚度明顯增加并發(fā)生嚴(yán)重纖維化，引起明顯的血管管重塑。與AngⅡ處理組相比，氯沙坦治療組幾乎完全抑制AngⅡ?qū)е碌墓鼙谠龊窈屠w維化，黃芪治療也可顯著降低AngⅡ引起的管壁增厚和纖維化(圖2)。

#P<0.05 compared with control and AngⅡ+Losartan group; *P<0.05, **P<0.01 compared with AngⅡ group圖1 黃芪對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠血壓升高的影響Fig 1 Effect of astragalus on AngⅡ induced elevation of blood pressure in mice

AngⅡ處理組Ⅰ型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著升高，氯沙坦可將其降低到對(duì)照組水平，而黃芪治療組表達(dá)水平介于二者之間(圖3)，與Masson染色結(jié)果相一致。

2.3 黃芪對(duì)ACE2及AT1R蛋白表達(dá)的影響

AngⅡ處理后可以顯著下調(diào)ACE2的表達(dá)并顯著上調(diào)AT1R的表達(dá)。氯沙坦治療幾乎完全逆轉(zhuǎn)上述改變，而黃芪則部分逆轉(zhuǎn)ACE2的下調(diào)和AT1R的上調(diào)(圖4)。

圖2 黃芪對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈增厚及纖維化增強(qiáng)的影響Fig 2 Effect of astragalus on AngⅡ induced thickening and increased fibrosis of aorta in mice (×10)

#P<0.05 compared with control and AngⅡ+Losartan group; *P<0.05 compared with AngⅡ group 圖3 黃芪對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈Ⅰ型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響Fig 3 Effect of astragalus on AngⅡ induced transcriptional expression of collagen Ⅰ of aorta in mice

#P<0.05 compared with control and AngⅡ+Losartan group; *P<0.05 compared with AngⅡ group 圖4 黃芪對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈ACE2及AT1R蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of astragalus on AngⅡ induced protein expression of ACE2 and AT1R of aorta in mice

3 討論

ACE2是降解AngⅡ?qū)蛊洳±碜饔玫年P(guān)鍵酶[3]，而AT1R是介導(dǎo)AngⅡ病理作用的關(guān)鍵受體[4]。本研究采用皮下埋微滲透泵持續(xù)泵入AngⅡ的方法建立血管重塑模型，結(jié)果顯示：AngⅡ使主動(dòng)脈管壁明顯增厚、纖維化增強(qiáng)，收縮壓顯著增高，表明模型建立成功[5]；AT1R拮抗劑-氯沙坦幾乎可以完全逆轉(zhuǎn)AngⅡ引起的管壁增厚、纖維化和血壓升高；當(dāng)AngⅡ升高時(shí)，ACE2表達(dá)受抑制，而AT1R表達(dá)增加，這與既往研究的結(jié)果一致[6- 7]，進(jìn)一步證實(shí)了本研究血管重塑模型的可靠性。

黃芪是傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)氣固表、利水消腫及斂瘡生肌之功效。黃芪的化學(xué)成分十分復(fù)雜，包括皂甙類、黃酮類、多糖類以及各種微量元素，因此，其藥理作用也十分廣泛。研究表明，在心血管系統(tǒng)，黃芪具有降低血壓、保護(hù)心肌、對(duì)抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮舒張功能、對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[8- 12]。但是，黃芪對(duì)血管重塑的影響尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪口服液灌胃可以顯著抑制AngⅡ引起的血壓升高和血管重塑，起到相當(dāng)于氯沙坦一半的效果。氯沙坦是AT1R的特異性阻斷劑，因此可以完全對(duì)抗AngⅡ的作用。黃芪部分對(duì)抗AngⅡ的作用提示其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是間接的。進(jìn)一步檢測(cè)ACE2及AT1R證實(shí)，黃芪可以部分上調(diào)ACE2并下調(diào)AT1R，其調(diào)控二者表達(dá)的水平與其治療作用相關(guān)。因此，黃芪可能通過(guò)調(diào)控ACE2及AT1R的表達(dá)對(duì)抗AngⅡ誘導(dǎo)的血管重塑。本研究采用的黃芪注射液為黃芪粗提物，包含黃芪皂甙、黃酮、多糖等多種成分。既往研究表明，黃芪皂甙及黃芪總黃酮對(duì)缺血缺氧心肌具有保護(hù)作用，而黃芪多糖在調(diào)節(jié)免疫及抗衰老方面可能發(fā)揮更大作用。在本研究中，粗體物中的哪一種或哪幾種成分、通過(guò)與哪些分子結(jié)合起到調(diào)控ACE2及AT1R表達(dá)的作用尚不清楚，有待采用黃芪的單一提取物做進(jìn)一步研究。此外，黃芪不完全對(duì)抗AngⅡ的作用提示黃芪可能具有較小的副作用。探討聯(lián)合其他作用溫和的藥物，達(dá)到最大療效及最小副作用的目的，也是未來(lái)研究的方向之一。

[1] Wei Y, Schober A, Weber C. Pathogenic arterial remodeling: the good and bad of microRNAs[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013, 304: 1050- 1059.

[2] 吳發(fā)寶，陳希元. 黃芪藥理作用研究綜述[J]. 中藥材, 2004, 27: 232- 234.

[3] Patel VB, Parajuli N, Oudit GY. Role of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) in diabetic cardiovascular complications[J]. Clin Sci (Lond), 2014, 126: 471- 482.

[4] Moon JY. Recent Update of Renin-angiotensin-aldosterone System in the Pathogenesis of Hypertension[J]. Electrolyte Blood Press, 2013, 11: 41- 45.

[5] McKinney CA, Fattah C, Loughrey CM,etal. Angiotensin-(1-7) and angiotensin-(1-9): function in cardiac and vascular remodelling[J]. Clin Sci (Lond), 2014, 126: 815- 827.

[6] Xu F, Mao C, Hu Y,etal. Cardiovascular effects of losartan and its relevant clinical application[J]. Curr Med Chem, 2009, 16: 3841- 3857.

[7] Patel VB, Clarke N, Wang Z,etal. Angiotensin Ⅱ induced proteolytic cleavage of myocardial ACE2 is mediated by TACE/ADAM- 17: a positive feedback mechanism in the RAS[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014, 66: 167- 176.

[8] Zhu H, Gao Y, Wang Z,etal. Astragalus polysaccharide suppresses the expression of adhesion molecules through the regulation of the p38 MAPK signaling pathway in human cardiac microvascular endothelial cells after ischemia-reperfusion injury[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013, 2013: article ID280493.

[9] Ma X, Zhang K, Li H,etal. Extracts from Astragalus membranaceus limit myocardial cell death and improve cardiac function in a rat model of myocardial ischemia[J]. J Ethnopharmacol, 2013, 149: 720- 728.

[10] Chen R, Shao H, Lin S,etal. Treatment with Astragalus membranaceus produces antioxidative effects and attenuates intestinal mucosa injury induced by intestinal ischemia-reperfusion in rats [J]. Am J Chin Med, 2011, 39: 879- 887.

[11] Zhang N, Wang XH, Mao SL,etal. Astragaloside IV improves metabolic syndrome and endothelium dysfunction in fructose-fed rats [J]. Molecules, 2011, 16: 3896- 3907.

[12] Wang D, Zhuang Y, Tian Y,etal. Study of the effects of total flavonoids of Astragalus on atherosclerosis formation and potential mechanisms[J]. Oxid Med Cell Longev, 2012, 2012: 282- 383.