產(chǎn)角質(zhì)酶酵母菌的發(fā)現(xiàn)與鑒定及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

冉琴琴 張效寧 張文坤 張學(xué)俊 張萌萌

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

從植物中提取天然活性成分化合物，即從植物的組織結(jié)構(gòu)中溶出這些化合物，并使之與固體組織分離。傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物提取方法有堿煮法、酸煮法以及水煮或醇煮法，但這些方法都涉及到高溫蒸煮，對(duì)藥效好的高活性藥物可能造成活性喪失；特別是酸性或堿性條件下，還有可能改變化合物的藥效結(jié)構(gòu)，如苷鍵、酯鍵的水解等。環(huán)境污染明顯也是傳統(tǒng)方法的一大弊端。酶降解提取植物中天然藥物成分方法是一種溫和的提取方法，因?yàn)榻M織結(jié)構(gòu)的破壞，多種組分可一并溶出，顯著地減少提取液的用量，降低污染，降低單一組分的提取成本；多種天然產(chǎn)物的同時(shí)溶出，可提高分離純化的效率，降低純化的成本；此外，酶法提取最大的特點(diǎn)就是反應(yīng)條件溫和，酶作為一種生物催化劑，具有高效性、底物專(zhuān)一性等特點(diǎn)，在反應(yīng)中不會(huì)發(fā)生副反應(yīng)，保證了植物中有效成分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)不被破壞，有利于后續(xù)生產(chǎn)。杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）是中國(guó)特有的名貴經(jīng)濟(jì)樹(shù)種［1，2］，杜仲葉與杜仲皮中的化學(xué)成分十分相似，有著同樣的藥理作用，而且杜仲葉中還含有多種杜仲皮中所沒(méi)有的成分，杜仲屬于落葉喬木，其葉子是可再生的，資源豐富［3］，相比于杜仲皮更具有開(kāi)發(fā)價(jià)值。杜仲葉中的杜仲膠、綠原酸、桃葉珊瑚苷、杜仲黃酮、木脂素等多種成分的同時(shí)提取是對(duì)自然資源的充分利用和保護(hù)，最終使整個(gè)生產(chǎn)獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

但是，用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶等生物酶降解葉片植物組織和細(xì)胞壁［4，5］時(shí)，在葉片組織的最外層有一層保護(hù)植物組織不受外界生物浸蝕的角質(zhì)保護(hù)層，阻擋了各種酶降解植物組織的作用。當(dāng)致病菌入侵植物時(shí)，必須分泌出角質(zhì)酶降解角質(zhì)層，破壞角質(zhì)層后方可侵入到植物內(nèi)部。同樣，欲用酶水解植物葉片，必須先水解表面的角質(zhì)層。

目前的研究已證明，角質(zhì)酶是降解角質(zhì)層的最主要的功能酶。而在自然界中，角質(zhì)酶的來(lái)源十分有限，僅有微生物和花粉［6］兩個(gè)途徑。產(chǎn)角質(zhì)酶的微生物也很少，主要為植物的病原真菌，至今尚無(wú)有關(guān)于產(chǎn)角質(zhì)酶酵母菌的報(bào)道。相對(duì)于病原真菌的培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，酵母菌的意義更為重大，因?yàn)榻湍妇L(zhǎng)周期比其他病原真菌短，且對(duì)環(huán)境來(lái)說(shuō)不具有病原真菌的危害性，是安全的。

角質(zhì)酶（EC3.1.1.74）是一種多功能酶［7］，具有屬于α/β 水解酶折疊的共同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可以降解角質(zhì)產(chǎn)生大量的脂肪酸［8］，也可以水解甘油三酯等化合物［8，9］。角質(zhì)酶是絲氨酸水解酶家族中較小的成員。因?yàn)榻琴|(zhì)酶能夠水解短鏈或長(zhǎng)鏈酯類(lèi)，還能夠催化酸與醇的酯化、脂肪酸鹽與醇的轉(zhuǎn)酯化等反應(yīng)，在食品工業(yè)、制藥工業(yè)、化工工業(yè)及印染工業(yè)等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［10］，因此，對(duì)產(chǎn)角質(zhì)酶菌株的研究意義十分重大。本研究從病變的杜仲葉分離出一株能高產(chǎn)角質(zhì)酶的菌種，鑒定分析證實(shí)該菌株是膠紅酵母，并對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)角質(zhì)酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為角質(zhì)酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 對(duì)硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，PNB）購(gòu)自Sigma 公司；杜仲葉購(gòu)買(mǎi)于貴州省遵義市遵義縣新舟鎮(zhèn)金仲村；馬鈴薯購(gòu)于附近市場(chǎng)；NaNO3、K2HPO4、MgSO4、KCl、FeSO4·7H2O、瓊脂、葡萄糖、草酸、草酸銨、Na2HPO4、KH2PO4等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g（液體培養(yǎng)基中不加瓊脂），蒸餾水 1 000 mL。富集培養(yǎng)基［11］：馬鈴薯20%，葡萄糖 2%，KH2PO4·3H2O 0.5%，硫胺素（VB1）0.008%。篩選培養(yǎng)基：NaNO33.0 g；K2HPO41.0 g；KCl 0.5 g；FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊 脂17 g，蒸 餾 水1 000 mL，角質(zhì)0.2%。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基［12］：葡萄糖 1.0%，NaNO30.6 g/L，K2HPO40.6 g/L，MgSO40.2 g/L，KCl 0.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，角質(zhì)0.1%。

以上培養(yǎng)基除需要特別要求的pH 用HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)外，其余的均為自然pH，于121℃滅菌20 min，冷卻至室溫備用。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離 挑選病變的杜仲葉揉碎，取少量加入富集培養(yǎng)基中在30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d 后，取其培養(yǎng)液用無(wú)菌水按一定倍數(shù)稀釋涂布，接種于篩選培養(yǎng)基的平板上培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行觀(guān)察識(shí)別，將識(shí)別的不同菌株分別在不同的PDA 平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)，連續(xù)分離操作3 次，對(duì)菌株反復(fù)進(jìn)行分離、純化。

1.2.2 角質(zhì)酶酶活的測(cè)定 酶活測(cè)定［13］：以對(duì)硝基苯丁酸酯（PNB）為底物測(cè)定酶的活力。反應(yīng)體系為1.8 mL，包括200 μL 的粗酶液、200 μL 0.4%的Tritonx-100、1 380 μL 50 mmol/L 磷 酸 鹽 緩 沖 液（pH7.0）和20 μL 1.76%的PNB 溶液。于37℃反應(yīng)10 min 后，在波長(zhǎng)405 nm 處測(cè)定吸光度值。在反應(yīng)條件下，將每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生1 μg 的對(duì)硝基苯酚定義為1 個(gè)酶活單位，即1 U/mL。

其中，OD：吸光值；V：反應(yīng)體系的體積，1.8 mL；Mr：產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的分子量，139.11 g/mol；ε：摩爾消光系數(shù)，6 830 L/（mol·cm）；λ：比色皿的光程，0.5 cm；V1：酶液體積，200 μL；T：反應(yīng)時(shí)間10 min。

1.2.3 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：將儲(chǔ)備于低溫冰箱中的菌種接入斜面種子培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)48 h，然后接種于裝有100 mL 液體PDA 的250 mL 錐形瓶中，30℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)36 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將菌種活化后接種到裝有100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)的250 mL 錐形瓶里，置于30℃恒溫?fù)u床中、160 r/min 環(huán)境下培養(yǎng)。6 d 后將發(fā)酵液用12 層紗布過(guò)濾，濾液再于5 500 r/min 4℃下離心30 min，上清即為粗酶液，用于酶活測(cè)定。

1.2.4 菌種鑒定方法 首先按SK8229 真菌基因組DNA 抽提試劑盒的要求提取DNA，并以提取得到的真菌DNA 作為模板，再使真菌通用引物擴(kuò)增18S rDNA 的序列。上游引物NS1 為：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'，下游引物NS6 為：5'-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3'。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性25 s，55℃退火25 s，72℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。取10 μL PCR 的反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳。產(chǎn)物在上海生工生物工程股份有限公司對(duì)該菌株進(jìn)行基因和結(jié)構(gòu)方面的鑒定。

1.2.5 分離方法與依據(jù) 為了有針對(duì)性的選育能有效地降解杜仲葉表面角質(zhì)層的菌株，首先將采來(lái)的杜仲葉發(fā)水，有利于霉菌在杜仲葉表面附著繁殖。在不同的環(huán)境，室內(nèi)、室外、陰暗處、土壤表面等條件下進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)置于的大盆中，覆蓋有塑料膜的潮濕杜仲葉有一部分發(fā)生了病變，長(zhǎng)出較少的菌斑。仔細(xì)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，有的菌斑剝離后，杜仲葉表面有潰瘍現(xiàn)象，說(shuō)明這部分菌斑有產(chǎn)角質(zhì)酶的能力。

植物角質(zhì)是高等植物表層的一種生物聚酯，其單體主要由十六碳、十八碳的羥基脂肪酸和環(huán)氧脂肪酸組成，而角質(zhì)水解的過(guò)程中降解出來(lái)的脂肪酸產(chǎn)物會(huì)降低培養(yǎng)基中的pH。能產(chǎn)生角質(zhì)酶的菌種在一種經(jīng)改良的查彼克—多克斯（Zapek-Dox）選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在這種培養(yǎng)基中含有作為菌種唯一碳源的純角質(zhì)和一種酸堿指示劑。能產(chǎn)生角質(zhì)酶的菌株，在這種培養(yǎng)基中，由于酸堿性指示劑的作用，在菌絲的前端產(chǎn)生顏色變化帶。這是由于菌種產(chǎn)生角質(zhì)酶將角質(zhì)降解生成脂肪酸，使培養(yǎng)基中的pH值下降而導(dǎo)致的。這是一種簡(jiǎn)便、快速而靈敏的測(cè)定真菌產(chǎn)生角質(zhì)酶的分析法［14］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道此方法最初是用于觀(guān)察引起木瓜炭疽病菌產(chǎn)生的缺乏角質(zhì)酶突變體，但它也可以用來(lái)測(cè)定其它真菌產(chǎn)生的角質(zhì)酶。

酸堿指示劑一般是有機(jī)弱酸或有機(jī)弱堿，其共軛酸堿形式具有明顯不同的顏色。但酸堿指示劑本身具有酸堿性質(zhì)，也會(huì)消耗少量的脂肪酸，用量過(guò)大會(huì)使色帶的變化不明顯而引起較大的誤差。在不同濃度下測(cè)驗(yàn)指示劑，以了解由于pH 的降低所引起的指示劑最佳顏色變化。本試驗(yàn)中所選用指示劑指示范圍見(jiàn)表1。

表1 指示劑指示范圍

2 結(jié)果

2.1 指示劑的確定

將分離前的菌株群接入含有不同指示劑的篩選培養(yǎng)基上，置于27℃下培養(yǎng)，并觀(guān)察記錄各菌種生長(zhǎng)及培養(yǎng)基顏色變化，結(jié)果見(jiàn)表2。將篩選培養(yǎng)基中的角質(zhì)替換成0.2%的葡萄糖，其它操作處理同上，置于27℃下培養(yǎng)，并觀(guān)察記錄各菌種生長(zhǎng)及培養(yǎng)基顏色變化，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 分離前的菌群在含不同指示劑的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

表3 分離前的菌群在不含角質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

2.2 產(chǎn)角質(zhì)酶菌種的篩選

指示劑顯色反應(yīng)證明，發(fā)生病變的杜仲葉通過(guò)富集培養(yǎng)后，得到的菌株群具有產(chǎn)角質(zhì)酶的功能。但是這是多種菌株混合菌群。經(jīng)過(guò)多次反復(fù)的分離、培養(yǎng)，最終分離純化得到3 株比較強(qiáng)壯的菌種，分別為1 號(hào)粉紅色菌、2 號(hào)粉墨綠色菌和3 號(hào)白色菌（圖1）。

圖1 分離得到的3 種菌

將所選的菌種接入加有指示劑的PDA 平板培養(yǎng)基上，于27℃下培養(yǎng)48 h 后，觀(guān)察各菌種生長(zhǎng)情況，挑選各菌種生長(zhǎng)比較好的平板，在平板中間放入滅過(guò)菌的牛津杯，向其中加入0.1 mL 1.76%的PNB，6 h 后觀(guān)察記錄各菌平板顏色變化（表4）。

表4 病菌生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)基顏色變化

指示劑的顏色反應(yīng)表明，1 號(hào)和2 號(hào)分離菌株具有明顯的產(chǎn)角質(zhì)酶功能，白色的3 號(hào)菌株幾乎不產(chǎn)角質(zhì)酶。為了進(jìn)一步研究這3 株菌株的產(chǎn)角質(zhì)酶功能，對(duì)它們進(jìn)行了產(chǎn)角質(zhì)酶酶活的測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)室中以確有產(chǎn)角質(zhì)酶功能的棉花枯萎病菌、蘋(píng)果炭疽病菌和煙草赤星病菌為對(duì)照，同時(shí)對(duì)以上分離所得的3 種菌株進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)，得到粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。從圖2 中可看出，分離得到的1 號(hào)粉紅菌株的酶活（產(chǎn)酶量）較高，僅次于棉花枯萎病菌的產(chǎn)酶量，高于蘋(píng)果炭疽病菌和煙草赤星病菌，是一株理想的產(chǎn)角質(zhì)酶的菌株，而2 號(hào)墨綠色菌株和3號(hào)白色菌株也具有產(chǎn)角質(zhì)酶的功能，只是產(chǎn)酶量和酶活僅為1 號(hào)粉紅菌株的一半，甚至更低。因此把研究的重點(diǎn)放在了1 號(hào)粉紅色菌株。

2.3 菌株的鑒定

在圖2 中的6 種菌中，分離1 號(hào)菌種的產(chǎn)酶量相對(duì)較高，僅次于實(shí)驗(yàn)室已有的棉花枯萎病菌，是在實(shí)驗(yàn)室中從杜仲葉上生長(zhǎng)出來(lái)的未知的菌株。對(duì)這一新菌株進(jìn)行了形貌、生化及結(jié)構(gòu)的研究。對(duì)分離1 號(hào)菌種進(jìn)行制片和顯微鏡觀(guān)察（圖3），可看出菌種表面平滑，在顯微鏡下呈橢圓形，出芽繁殖，有芽孢。初步判定該菌為酵母菌。

將分離得到的1 號(hào)菌株接到斜面上，培養(yǎng)2 d后，進(jìn)行凝膠電泳分析。結(jié)果（圖4）顯示，擴(kuò)增的DNA 片段IS180 在約1 500 bp（base pair）處有一條明亮的PCR 特征性條帶，用Applied Biosystems 3730XL 測(cè)序軟件得出該菌株的DNA 序列為T(mén)AAGTTTAAG-----------GGACTATCCA 且長(zhǎng)度為1 339 bp。將所獲得的DNA 在NCBI 上進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，有5 種菌株匹配性最高，且都屬于Rhodotorula mucilaginosa（膠紅酵母），它們的匹配E 值為0，Ident 值為100%，覆蓋率為99%。通過(guò)比對(duì)，從NCBI 的核酸基因數(shù)據(jù)庫(kù)中得到11 條與1 號(hào)菌的PCR 擴(kuò)增序列匹配性、覆蓋率、E 值、匹配一致性最相符的序列。

圖4 DNA 電泳圖

將這11 條序列與1 號(hào)菌PCR 擴(kuò)增所得序列在MEGA5.0 軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。

圖5 MEGA5.0 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 顯示，1 號(hào)菌與膠紅酵母18S rRNA 克隆的部分序列（Uncultured fungus clone nco85d05c1 18S ribosomal RNA gene，partial sequence）都屬于真菌膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。而且，分離1號(hào)菌與膠紅酵母菌株ZM-1 18S rRNA 部分序列［（Rhodotorula mucilaginosa strain ZM-1 18S ribosomal RNA gene，partial sequence（序列號(hào)為GQ433375.1）］的親緣關(guān)系最近，因此可判定1 號(hào)菌株是膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）。

2.4 1號(hào)菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1 最佳碳源 在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖作為碳源，濃度均為1%，培養(yǎng)6 d 后測(cè)酶活，結(jié)果（圖6）顯示，在分離1 號(hào)菌發(fā)酵產(chǎn)角質(zhì)酶的培養(yǎng)基中，最適合其發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶的碳源是乳糖，其次是葡萄糖，因此將該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源換為乳糖。

圖6 最佳碳源的篩選結(jié)果

2.4.2 最佳氮源 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別以酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、氯化銨和硝酸鈉為其氮源，濃度均為1%進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d 后測(cè)酶活，結(jié)果（圖7）顯示，最適合該菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶的氮源是酵母粉，蛋白胨次之，因此將該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源定為酵母粉。

圖7 最佳氮源的篩選結(jié)果

2.4.3 1 號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn) 將保存的1 號(hào)菌接入液體PDA 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18 h 后，以10%的接種量接入裝有200 mL 液體PDA 培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，置于30℃、160 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 取其發(fā)酵液，用未接種的空白培養(yǎng)液做參比，在波長(zhǎng)為600 nm 處測(cè)定其吸光度。生長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖8）表明該菌培養(yǎng)4 h 后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)繁殖迅速，培養(yǎng)到30 h 后，該菌進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)繁殖基本進(jìn)入平穩(wěn)期。

圖8 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.4.4 產(chǎn)角質(zhì)酶最佳時(shí)間 通過(guò)生長(zhǎng)曲線(xiàn)的分析，將保存的分離1 號(hào)菌株活化1 d 后，接入裝有100 mL 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（將葡萄糖換為乳糖，氮源換為酵母粉）的250 mL 錐形瓶中，置于30℃搖床中，160 r/min 振蕩培養(yǎng)，每天均勻取該菌發(fā)酵液8 mL 于5 500 r/min、4℃離心30 min，上清液用于測(cè)定酶活。結(jié)果（圖9）顯示，該菌的產(chǎn)酶最佳時(shí)間為5 d，前5 d 角質(zhì)酶的含量持續(xù)增加，第5 天達(dá)到最高，之后角質(zhì)酶含量有輕微的減少，最佳時(shí)間選為5 d。對(duì)比圖8 和圖9，說(shuō)明菌的生物量達(dá)到最大時(shí)的時(shí)間很短，而產(chǎn)生角質(zhì)酶最大酶活的時(shí)間則需5 d 時(shí)間。

圖9 產(chǎn)酶最佳時(shí)間

2.4.5 最適溫度 保存的分離1 號(hào)菌活化1 d 后，接入裝有100 mL 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（將葡萄糖換為乳糖，氮源換為酵母粉）的250 mL 錐形瓶中，分別置于20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃的搖床中，160 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d 后，按照1.2.3 的方法處理，用于測(cè)定酶活。溫度對(duì)角質(zhì)酶活性的影響（圖10）顯示，該菌最適發(fā)酵產(chǎn)酶的溫度為28℃。

圖10 產(chǎn)酶最適溫度

2.4.6 培養(yǎng)基的初始pH 分別用稀鹽酸和稀氫氧化鈉將發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（碳源換為乳糖）的pH 調(diào)至：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0 七個(gè)梯度，將分離1 號(hào)菌種活化1 d 后，分別接入裝有100 mL 不同pH 梯度培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，置于28℃搖床中，160 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d 后，測(cè)定酶活。圖11 顯示，初始pH 為6.5 時(shí)最有利于該菌發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)角質(zhì)酶。

圖11 初始pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響

3 討論

杜仲葉中含有大量的活性藥物成分，存在葉片細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞間，在提取這些物質(zhì)時(shí)破壞植物組織和細(xì)胞壁就可以釋放出這些藥物成分。杜仲葉的細(xì)胞壁可用纖維素酶和果膠酶降解，但其最外層的角質(zhì)層保護(hù)葉片免受生物酶和微生物的破壞，成為如今對(duì)降解植物組織最為關(guān)注的技術(shù)難點(diǎn)。角質(zhì)酶（EC3.1.1.74）是一種多功能酶，理論上可降解角質(zhì)層。將角質(zhì)酶用于酶解法提取杜仲葉中的活性成分，將比傳統(tǒng)的堿浸法帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)和物質(zhì)效益。

鑒于目前無(wú)大規(guī)模生產(chǎn)角質(zhì)酶的研究，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)角質(zhì)酶進(jìn)行了大量研究，江南大學(xué)做了很多關(guān)于產(chǎn)角質(zhì)酶發(fā)酵條件優(yōu)化［15］、基因重組改良等方面研究［16］，但還未見(jiàn)有分離可產(chǎn)角質(zhì)酶的微生物的報(bào)道。本試驗(yàn)從杜仲中分離能產(chǎn)角質(zhì)酶的微生物，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株屬于膠紅酵母。這是首次發(fā)現(xiàn)酵母菌能產(chǎn)角質(zhì)酶，而且酶活較高，可達(dá)到10 U/mL 左右。這一發(fā)現(xiàn)具有重大的實(shí)踐意義，因?yàn)橥ǔ８弋a(chǎn)角質(zhì)酶的真菌都是植物的病原真菌，在生產(chǎn)角質(zhì)酶進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)必須嚴(yán)格控制生產(chǎn)環(huán)境，而本研究發(fā)現(xiàn)的是酵母菌，可以大規(guī)模培養(yǎng)，不會(huì)對(duì)環(huán)境帶來(lái)危害。本試驗(yàn)還對(duì)該菌產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化培養(yǎng)條件的過(guò)程中，除了要選擇的適合菌株生長(zhǎng)并且不會(huì)對(duì)角質(zhì)酶產(chǎn)量造成影響的碳源和氮源外，還要選擇合適的溫度、初始pH 和適當(dāng)?shù)木g，要適宜菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)角質(zhì)酶。本研究分別考察了發(fā)酵的碳源、氮源、溫度、時(shí)間和初始pH 值等對(duì)膠紅酵母產(chǎn)角質(zhì)酶的影響。在選擇適當(dāng)?shù)木g時(shí)，一般以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期較為適宜，太年輕的種子接種后，往往會(huì)使發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)過(guò)于緩慢，使得發(fā)酵周期延長(zhǎng)；過(guò)老的種子雖然菌量較多，但接種后菌體會(huì)過(guò)早自溶，導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降。所以本研究通過(guò)測(cè)定菌種的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，得出將該菌活化1 d 后的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，以保證產(chǎn)酶量。

由于膠紅酵母比植物病原真菌更安全，因此可廣泛用于角質(zhì)酶制劑的生產(chǎn)，可以繼續(xù)進(jìn)行菌株的誘變研究，進(jìn)一步提高該酵母的角質(zhì)酶產(chǎn)量。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)將病變的杜仲葉分離所得的3 株菌中，分離1 號(hào)菌產(chǎn)角質(zhì)酶量最高，經(jīng)形態(tài)觀(guān)察及菌種鑒定、序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建等判定分離1 號(hào)菌為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。這是首次發(fā)現(xiàn)酵母菌產(chǎn)角質(zhì)酶且酶活較高（10 U/mL）的菌株。對(duì)膠紅酵母產(chǎn)角質(zhì)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了該菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶的最佳碳源（乳糖）、氮源（酵母粉）、最佳溫度（28℃）、時(shí)間（5 d）和初始pH 值（6.5）。

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